李妙，馬璐，柏青，陳雯，陳麗萍*

（中山大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學系，廣東 廣州510080）

PP2A B56α亞基介導鎘誘導的
細胞毒性

李妙，馬璐，柏青，陳雯，陳麗萍*

（中山大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學系，廣東 廣州510080）

鎘及其化合物是環(huán)境中常見的重金屬污染物，長期的鎘暴露與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［1］。研究表明在鎘誘導人支氣管上皮細胞惡性轉化的過程中，鎘可以誘導細胞發(fā)生凋亡、DNA損傷、DNA損傷修復能力下降以及基因組不穩(wěn)定［2］。然而，其毒作用的分子機制至今仍未闡明。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是真核生物中最主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族，調控信號轉導、細胞增殖、細胞周期、細胞轉化、細胞凋亡等多種細胞生命事件［3-6］。PP2A全酶由核心酶（支架A亞基和催化C亞基組成）與不同的調節(jié)B亞基組成，形成至少75種不同組合的PP2A全酶［7］。因此，B亞基的多樣性決定了PP2A功能的多樣性，特定的PP2A全酶參與特定的信號通路。在我們前期的研究中，發(fā)現(xiàn)PP2A全酶的活性與鎘誘導的毒性效應密切相關［8］，然而，PP2A通過哪些信號通路來調控鎘誘導的細胞毒性有待闡明。本實驗室前期利用PP2A亞基缺失細胞模型篩查影響鎘誘導細胞毒性的PP2A亞基，發(fā)現(xiàn)特異的PP2A亞基如PR110、B56δ 表達抑制后增加鎘誘導的細胞毒性［9-10］，與此相反，B56α亞基的表達缺失導致細胞對鎘誘導的細胞毒性抵抗。為了闡述B56α在鎘誘導的細胞毒性中的作用，本研究在人胚腎上皮細胞HEK構建了PP2A B56α表達降低的細胞模型，并用氯化鎘染毒，觀察PP2A B56α低表達對鎘誘導的細胞毒性及相關信號通路的影響，探討B(tài)56α調控鎘誘導的細胞毒性的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和質粒

MEMα基礎培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司）；Cell Proliferation Kit （WST-1）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）抑制劑SP600125（上海碧云天公司）；氯化鎘（CdCl2，購自美國Sigma公司）；anti-B56α抗體（Novus，美國），抗金屬硫蛋白（metallothionein， MT）抗體（Genetex，美國），p-JNK抗體（Thr183/Tyr185） （CST，美國）。慢病毒質粒pLKO.1-puro-SHB56α-1和pLKO.1-puro-SHB56α-2（靶向PPP2R5A的不同序列）由美國哈佛大學醫(yī)學院Hahn教授贈送。

1.2 細胞培養(yǎng)

永生化人胚腎上皮細胞HEK由美國哈佛大學醫(yī)學院Hahn教授贈送，在含有10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 PP2A B56α缺陷細胞株的構建 pLKO.1-puro-SHB56α和包裝質粒VSVG、△8.9通過磷酸鈣法穩(wěn)定轉染293FT細胞，獲得含有目的基因的病毒顆粒。病毒顆粒通過0.45 μm濾器過濾后感染HEK細胞，經嘌呤霉素篩選，免疫印跡驗證，獲得B56α缺陷細胞株HEKSHB56α-1和HEK-SHB56α-2。同步轉染pLKO.1-puro-SHGFP獲得對照細胞HEK-SHGFP。

1.3.2 細胞毒性實驗分別收集細胞，消化后按每孔6×103個細胞用排槍接種到96孔板，貼壁培養(yǎng)24 h。按濃度0、10、20、40、80 μmol/L配制CdCl2染毒液。將細胞培養(yǎng)基吸走，每孔加入100 μL染毒液繼續(xù)培養(yǎng)24h。傾斜培養(yǎng)板，小心吸棄染毒液，再加入含10 μL WST-1溶液的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1.5h，置搖床上混勻5 min，使用酶標儀于570 nm波長處測定各孔吸光度值。以細胞相對活力評估細胞毒性大小，其計算公式為：

細胞相對活力=［處理組D（570）值-空白孔D（570）值］/［對照組D（570）值-空白孔D（570）值］×100%

1.3.3 免疫印跡檢測B56α和MT的表達以及JNK的磷酸化水平 細胞消化后按每皿5×105個接種，貼壁培養(yǎng)24 h，用終濃度為0、10、20、40、80 μmol/L的CdCl2染毒24 h，或用40 μmol/L的CdCl2染毒不同時間（在0、2、6、12、24 h收集）。另設SP600125與CdCl2同時處理組：相應濃度的CdCl2染毒液加終濃度為10μmol/L的SP600125溶液。細胞收集后直接用2×SDS上樣緩沖液裂解以獲得總蛋白，并使用細胞破碎儀（30%，超聲5 s，停頓1 s）處理樣品，6%～12%梯度膠分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移到NC膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后分別加入抗B56α（1∶2 000）、p-JNK （Thr183/Tyr185）（1∶1 000） 以及MT（1∶800）的抗體4℃ 孵育過夜，次日用PBS/T洗3次，每次5 min，再加入山羊抗兔或抗鼠IgG-HRP （1∶10 000），室溫孵育1 h。加上ECL發(fā)光劑進入暗室使用X光膠片曝光成像。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 PP2A B 56α表達抑制對CdCl2誘導細胞毒性的影響

在調控鎘誘導細胞毒性的PP2A亞基的初步篩查中發(fā)現(xiàn)B56α缺失降低鎘誘導的細胞毒性。為了進一步驗證，將靶向B56α的兩個有效干擾片段（排除靶外效應）導入HEK細胞，構建B56α表達降低的穩(wěn)定細胞株。圖1A和B顯示，HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2細胞中B56α 的表達分別為對照細胞HEK-SHGFP的21%和28% （P＜ 0.05），表明PP2A B56α表達降低的細胞株構建成功。用不同劑量的CdCl2染毒細胞株24 h，圖1C顯示隨著CdCl2染毒劑量的增加，細胞相對活力逐漸下降。和對照細胞相比，PP2A B56α表達降低的細胞株的相對活力升高了10%～32% （P＜0.05），提示B56α表達降低導致鎘誘導的細胞毒性降低。以上結果表明B56α在鎘誘導的細胞毒性中起作用。

2.2 CdCl2對JNK磷酸化的誘導作用

用不同劑量（0、10、20、40、80 μmol/L）的CdCl2處理HEK細胞，發(fā)現(xiàn)JNK（Thr183/Tyr185）的磷酸化水平（p-JNK）和MT表達水平隨CdCl2的劑量增加而增加（P＜ 0.05）（圖2A）。當用40 μmol/L CdCl2處理HEK細胞不同時間（0、2、6、12、24 h）后，與處理0 h組相比，觀察到p-JNK和MT的表達水平隨時間增加逐漸增加（P＜ 0.05），在12 h達到峰值（圖2B）。這些結果提示JNK的磷酸化可能與MT的誘導表達相關。

2.3 JNK磷酸化增加促進MT的表達并降低鎘誘導的細胞毒性

為了進一步證實MT的表達受JNK的磷酸化調控，分別用20 μmol/L和40 μmol/L CdCl2處理HEK細胞12h，p-JNK和MT的表達水平顯著增加（圖3A和B）。然而，當聯(lián)合JNK抑制劑SP600125（10 μmol/L）作用時，p-JNK水平則下降35%～38%（P＜0.05），MT的表達也下降了13%～35%（P＜0.05），表明抑制JNK的磷酸化激活導致MT的表達下降。同時觀察到在JNK抑制劑SP600125和CdCl2同時作用下，HEK細胞的細胞相對活力降低6%～ 20% （P＜0.05） （圖3C）。以上這些結果進一步證實JNK磷酸化激活影響MT的表達，且JNK磷酸化和MT的表達增加可以抵抗CdCl2誘導的細胞毒性。

2.4 抑制PP2A B56α表達對JNK磷酸化水平的影響

為了證實PP2A B56α可能通過調控JNK的磷酸化來調控MT表達的推測，用40 μmol/L CdCl2處理B56α表達降低的細胞株HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2，觀察B56α表達降低對CdCl2誘導JNK磷酸化水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)，與HEK-SHGFP細胞相比，上述2株細胞中的JNK的磷酸化水平分別增加了2.78倍和1.26倍（P＜0.05），同時MT的表達也分別增加了1.36倍和1.19倍（P＜0.05）（圖4A），提示JNK磷酸化水平受PP2A B56α調控。此外，還發(fā)現(xiàn)用40 μmol/L CdCl2作用HEK細胞不同時間（0、2、6、12、24 h），和處理0 h組相比，B56α的表達水平呈下降趨勢（P＜0.05），JNK的磷酸化則顯著增加（P＜0.05），MT的表達也呈升高的趨勢（P＜0.05）（圖4B），提示在重金屬應激下，B56α降低有利于激活JNK 調控MT表達的相關通路。以上結果進一步說明PP2A B56α可能通過調控JNK的磷酸化水平來影響MT的表達，進而影響CdCl2誘導的細胞毒性。

3 討 論

鎘的長期暴露與DNA損傷、細胞凋亡、氧化應激等多種分子事件相關［2］。近年來，PP2A相關信號通路在環(huán)境化學物毒性通路中的作用受到廣泛的關注［4，6，9，11］。PP2A各亞基的突變缺失以及表達異常會導致PP2A功能失調。本研究發(fā)現(xiàn)PP2A B56α在鎘誘導的細胞毒性中起著重要的作用，并揭示了B56α通過介導JNK的去磷酸化來影響MT的表達，進而調控鎘誘導的細胞毒性的關鍵分子事件。

金屬硫蛋白（MT）是一類含半胱氨酸的小分子的金屬結合蛋白。它屬于應激蛋白，在重金屬或氧化應激時誘導表達升高［12-13］，能夠維持鋅銅穩(wěn)態(tài)、解除重金屬毒性、清除氧自由基等［14-16］。MT的表達升高可被認為是環(huán)境重金屬暴露毒性效應的保護機制［12］。因此，闡明MT的表達調控機制，有助于找到重金屬毒作用的關鍵信號通路，為重金屬污染物的防治提供靶點。

金屬調控轉錄因子-1（metal-regulatory transcription factor-1，MTF-1）是調控MT基因表達的關鍵因子［17］。研究表明MTF-1的活性受磷酸化調控，且由蛋白激酶PKC、 JNK、MKK4等介導［18］，其中JNK的磷酸化激活能進一步使MTF-1發(fā)生磷酸化，并促進其轉錄活性［18］。相一致的是，我們也觀察到CdCl2作用下JNK的磷酸化水平增加進而上調MT的表達。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kidnase，MAPK）超家族成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。JNK信號通路在細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡中起著重要的作用［19-20］。JNK信號通路可通過磷酸化促凋亡或抗凋亡相關蛋白而表現(xiàn)促進凋亡和抑制凋亡的兩面性［21-23］。而本研究發(fā)現(xiàn)JNK活性受抑制后導致CdCl2誘導的細胞毒性增加，可能原因是其抑制MTF-1的活性進而影響MT的誘導表達，這個結果進一步證實JNK在細胞對重金屬應激中起著重要作用。

特異PP2A全酶可以通過調控特定的信號通路來影響重金屬誘導的細胞毒性，我們以往的研究發(fā)現(xiàn)PP2A PR110通過去磷酸化作用激活MTF-1調控MT表達［9］，而PP2A B56δ抑制后增加鎘誘導的細胞毒性［9-10］。以往研究表明JNK的磷酸化受到蛋白磷酸酶的調控［24］。本研究則發(fā)現(xiàn)B56α通過調控JNK磷酸化來影響MT表達，表明B56α是CdCl2應激時決定細胞命運的關鍵分子。相一致的是，在心肌細胞JNK的持續(xù)激活通過上調AUF1使PP2A B56α表達降低［25］，表明JNK的磷酸化激活與PP2A B56α密切相關。然而，PP2A B56α是否直接調控JNK去磷酸化有待進一步闡明。

綜上，本研究揭示了PP2A B56α參與鎘誘導的細胞毒性的作用及分子機制。期望這些關鍵分子能為鎘暴露的毒性機制更深入的闡明提供線索和依據(jù)，為環(huán)境化學物毒性通路的預測提供理論依據(jù)。

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Role of PP2A B56 α subunit in cadmium-induced cytotoxicity

LI Miao，MA Lu，BAI Qing，CHEN Wen，CHEN Liping*（Faculty of Preventive Medicine， School of Public Health，
Sun-Yat Sen University， Guangzhou 510080， Guangdong， China）

目的：探 討蛋白磷酸酶2A（PP2A）B56α亞基在調控CdCl2誘導的細胞毒性中的作用及其機制。方法：利用病毒感染法在人胚腎上皮細胞HEK上構建PP2A B56α表達降低的細胞株模型（HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2），采用改良四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測CdCl2誘導的細胞毒性。用不同濃度（0、10、20、40和80μ mol/L）CdCl2聯(lián)合或不聯(lián)合c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制劑SP600125染毒細胞不同時間（0、2、6、12和24 h），采用免疫印跡檢測B56α亞基、金屬硫蛋白（MT）的表達和JNK的磷酸化水平。結果：免疫印跡結果證實細胞株HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2構建成功。與對照組比較，PP2A B56α表達抑制導致鎘誘導的細胞毒性減小，JNK的磷酸化水平和MT的表達水平均顯著增加。用不同劑量CdCl2處理細胞株12h ，發(fā)現(xiàn)B56α表達抑制導致JNK磷酸化（p-JNK）分別增加了2.78和1.26倍（P＜0.05），MT的表達也分別增加了1.36和1.19倍（P＜0.05）。用p-JNK抑制劑SP600125作用時，p-JNK的表達降低了35%～38%（P＜0.05），MT的表達下降了13%～35%（P＜0.05）， CdCl2誘導的細胞毒性顯著增加（P＜0.05）。此外，用CdCl2處理細胞不同時間點，B56α的表達逐漸降低（P＜0.05），而p-JNK和MT的表達水平呈逐漸增加趨勢（P＜0.05）。結論：PP2A B 56α在調控CdCl2誘導的細胞毒性中起著重要作用，其作用機制可能通過介導JNK的去磷酸化調控MT的表達而發(fā)揮作用。本研究揭示了PP2A參與重金屬應激的關鍵靶點和信號通路的調控。

氯化鎘；細胞毒性；蛋白磷酸酶2A；p-JNK；金屬硫蛋白

OBJECTIVE:To identify involvement of protein phosphatase 2A B56α in the regulation of cytotoxicity induced by cadmium chloride （CdCl2） and address the underlying molecular mechanism.METHODS：Stable cell lines were generated by infecting HEK cells with lentiviral shRNA targeting B56α subunit. Modified MTT was performed to detect the cytotoxicity induced by CdCl2. Immunoblotting analysis was applied to examine the expressions of B56α，p-JNK and MT in cells treated with different concentrations of CdCl2or co-treated with SP600125.RESULTS：Immunoblotting results verified that stable cell lines HEK-SHB56α-1 and HEK-SHB56α-2 were successfully established. We found that suppression of PP2A B56α reduced the cytotoxicity induced by CdCl2. In addition，the phosphorylation status of c-Jun N-terminal kinases （JNK） and the expression level of MT were significantly increased in response to CdCl2. Suppression of B56α led to a 2.78 or 1.26-fold（P＜0.05） increase of p-JNK in cells treated with CdCl2for 12 h，and a 1.36 or 1.19-fold （P＜0.05） increase of MT. Upon SP600125 treatment，the expression level of p-JNK and MT were reduced by 35%-38% （P＜0.05） and 13%-35%（P＜0.05），respectively，while cytotoxicity induced by CdCl2was enhanced（P＜0.05）. More-over，the expression of B56α was lowered（P＜0.05），but p-JNK and MT were increased（P＜0.05）in a time-dependent manner upon CdCl2treatment.CONCLUSION：PP2A B56α regulated MT expression via dephosphorylating JNK，and affecting the cytotoxicity induced by CdCl2. Our study demonstrated that PP2A B56α participated in regulating the targets and pathways in response to metallic stress.

CdCl2；cytotoxicity；protein phosphatase 2A；p-JNK；metallothionein

R994.6

A

1004-616X（2015）01-0011-06

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.003

2014-09-25；

2014-12-03

國家自然科學基金青年基金項目（31401213）

作者信息： 李妙，E-mail：michellelee3828@hotmail.com。*通信作者，陳麗萍，E-mail：chenliping_happy06@163.com