李 巖，趙英會，莊東明，李曉霞，于愛蓮*

（泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇致小鼠畸形骨骼組織差異表達基因及相關(guān)通路分析

李 巖，趙英會，莊東明，李曉霞，于愛蓮*

（泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是一種主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素［1］，它是谷類食物中的一種常見污染源。二十世紀(jì)初有報道DON與動物骨骼畸形有關(guān)，它能引起鳥類軟骨發(fā)育不全，小鼠的胸肋分節(jié)不正常等［2］。Collins等［3］研究結(jié)果顯示，DON可以引起多個部位的骨化程度下降、胸關(guān)節(jié)的不合并以及異常等。對于DON引起骨骼畸形的機制研究甚少，僅有Sergeev等［4］進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)口服DON的小鼠出現(xiàn)體內(nèi)鈣平衡紊亂。本研究采用具有準(zhǔn)確性高、數(shù)據(jù)可靠、高密度和高通量分析特點的NimbleGen 60mer小鼠全基因組12×135k長寡核苷酸基因表達譜芯片，檢測小鼠正常骨骼組織和畸形骨骼組織基因表達譜的變化。通過基因本體學(xué)（gene o ntology，GO）分析軟件，對差異表達基因的生物學(xué)功能進行注釋或基因分類，篩選出兩組之間具有顯著性差異的GO條目。通過DAVID database數(shù)據(jù)庫篩選骨骼組織差異表達基因所涉及到的信號傳導(dǎo)通路，為闡明DON致骨骼畸形的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DON毒素，購自Sigma公司；健康性成熟的昆明小鼠，購自山東大學(xué)實驗中心；Trizol試劑盒，購自Invitrogen公司；Mus musculus 12×135k小鼠全基因組寡核苷酸芯片，購自上?？党缮锕こ逃邢薰荆籒imbleGen 芯片雜交試劑盒，購自Roche公司。

1.2 動物模型的建立與取材

取妊娠母鼠30只，隨機分成空白對照組、溶劑對照組、低劑量DON染毒組、中劑量DON染毒組、高劑量DON染毒組共5組，每組各6只，空白對照組不作任何處理。溶劑對照組注射丙二醇和生理鹽水配制的溶劑，3個實驗組分別按4、6.4和10 mg/kg設(shè)置DON濃度梯度，于妊娠第7、8、9、10天連續(xù)腹腔注射。母鼠妊娠第18天，頸椎脫臼法處死母鼠，剖腹取出胎鼠并去除皮膚與內(nèi)臟，保留顱骨及脊柱骨架。

1.3 總RNA的提取

取100 mg新鮮椎體骨骼組織樣品，用Trizol法提取總RNA，操作方法按照試劑盒說明書。分光光度儀測定吸光度值D（260）和D（280），計算濃度。

1.4 cDNA基因表達譜芯片

進行cDNA的合成（參照Invitrogen Superscript雙鏈cDNA合成試劑盒），用Nanodrop進行cDNA定量和質(zhì)控。用NimbleGen單色DNA標(biāo)記試劑盒Cy3標(biāo)記已合成好的cDNA標(biāo)本。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下將標(biāo)記好的cDNA和cDNA基因表達譜芯片進行雜交（參照NimbleGen芯片雜交試劑盒）。cDNA基因表達譜芯片有44 170個不同的cDNA，以管家基因GAPDH作為內(nèi)參。雜交信號的熒光強度用GenPix4000B芯片掃描儀進行檢測。

將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用GenePix pro V6.0軟件讀取原始熒光值，并對原始數(shù)據(jù)進行分析運算。用t檢驗篩選兩組之間比較P＜0.05的基因且倍數(shù)變化大于2的為差異表達基因，P值越小，越有理由說明該基因在兩樣本間表達不同。

1.5 實時熒光定量PCR

選取對照組和實驗組中與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的6個差異表達基因，GAPDH作為內(nèi)參，用qPCR驗證芯片結(jié)果?？偡磻?yīng)體系25 μL，包括dNTP 2.5 μL，cDNA 1 μL，終濃度0.25× SYBR Green 2.5 μL，10 μmol/L正向和反向PCR特異性引物各1 μL，Tap聚合酶1 μL等。反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，然后在95 ℃、10 s變性、59℃、15 s退火，共35個循環(huán)，最后72℃ 、20 s延伸。

1.6 差異表達基因的功能分析及通路分析

采用基因本體學(xué)（gene ontology，GO）分析軟件，對篩選出的差異表達基因的生物學(xué)功能進行基因分類，篩選出在兩組之間具有顯著性差異的GO條目。從生物學(xué)過程、分子功能和細胞組分3個方面對基因的功能進行分類。采用Genespring GX軟件和DAVID database 數(shù)據(jù)庫對上述篩選到的差異基因所涉及到的信號通路進行檢索分析，探討DON致骨骼畸形的分子機制。

2 結(jié) 果

2.1 胎鼠骨骼組織差異表達基因的確定

對正常對照組胎鼠和母鼠DON染毒后所產(chǎn)畸形胎鼠椎體骨骼組織中反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA進行基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在總共的44 170個基因中，篩選出972個差異表達基因，占總數(shù)的2.20%，經(jīng)DON染毒后有445個基因表達下調(diào)，517個基因表達上調(diào)；差異倍數(shù)大于2倍的基因有282個（P＜0.05），其中上調(diào)基因134個，下調(diào)基因148個。表達上調(diào)的基因中與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的有Pax1、Fbn1、Col9a2、Papss2和Lgals3；表達下調(diào)的基因中與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的有Runx2、Pthlh、Hexb、s100a9。表達有顯著性差異的基因除了編碼與骨骼畸形有關(guān)的蛋白、胚胎畸形有關(guān)的蛋白（見表1），還包括編碼與癌癥、血液、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)等有關(guān)的蛋白以及未知功能的蛋白。

2.2 實時熒光定量PCR驗證結(jié)果

在小鼠胚胎骨骼組織差異表達的基因中，隨機選取6個基因Pax1、Runx2等做qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因和下調(diào)基因的變化趨勢和cDNA微陣列的變化趨勢一致，見圖1。

2.3 差異表達基因的功能分析結(jié)果

通過GO分析發(fā)現(xiàn)，對照組和實驗組椎體骨骼組織中差異表達的基因，有32.80%與生物過程有關(guān)，32.80% 與細胞組分有關(guān)，另有35.18%與分子功能有關(guān)。三方面中各亞層次所占比例見圖2～圖4。

2.4 差異表達基因信號傳導(dǎo)通路分析結(jié)果

經(jīng)DAVID database數(shù)據(jù)庫分析共涉及信號傳導(dǎo)通路153個。篩選出骨骼樣本差異表達基因通路分析結(jié)果中富集程度在前10位的通路與基因，見表2。在所涉及通路中已知與骨骼發(fā)育相關(guān)的差異表達通路為P53、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway、Cysteine and methionine metabolism、Notch、Jak-STAT signaling pathway、PPAR signaling pathway、Terpenoid backbone biosynthesis、Insulin signaling pathway、Calcium signaling pathway、Hedgehog signaling pathway等。上述通路中所涉及重要基因WNT10B，IKbKb，F(xiàn)GF11等表達明顯子異常。

3 討 論

骨骼組織的發(fā)育受到多種基因的調(diào)控，一旦基因在自我更新的過程中受到外界物理、化學(xué)和生物因素的影響后基因的表達發(fā)生改變，導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常。目前表達譜基因芯片在動物基因組和毒理基因組學(xué)中發(fā)揮重要作用。近年來有報道用基因芯片技術(shù)研究氟中毒對骨骼發(fā)育的影響，但DON 作為導(dǎo)致骨骼畸形的一個生物因素，其分子機制尚未見報道。

本研究應(yīng)用基因本體學(xué)對差異表達基因的生物學(xué)功能進行注釋和基因分類，在生物過程中，生物調(diào)節(jié)相關(guān)的差異表達基因占18%，包括細胞周期代謝過程的調(diào)節(jié)、大分子代謝過程的調(diào)節(jié)和基因表達調(diào)節(jié)等，這提示DON影響細胞代謝過程和骨骼發(fā)育基因的異常表達，導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常。而在分子功能中發(fā)現(xiàn)，36%的差異表達基因與結(jié)合有關(guān)，主要為蛋白結(jié)合、離子結(jié)合與陽離子結(jié)合等。早在90年代Sergeev等［5］就證明口服DON可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)鈣平衡紊亂。DON可能通過改變Ca2+濃度，造成成骨細胞增殖異常，出現(xiàn)骨骼發(fā)育障礙。

在差異表達的基因中Pax1編碼的蛋白質(zhì)可作為上游主調(diào)控因子在多個細胞信號傳導(dǎo)通路中起重要作用。在胚胎發(fā)育過程中可調(diào)控細胞分化、更新和凋亡。即使對一些已經(jīng)發(fā)生特定分化的細胞，對其細胞功能的保持也起到重要調(diào)控作用［5］，目前研究表明，Pax 基因的非正常表達會導(dǎo)致多種器官組織發(fā)育畸形［6］。 在敲除Pax1和Pax9基因的小鼠胚胎發(fā)育過程中完全觀察不到脊柱形成，Pax1或Pax9單個基因缺失的小鼠胚胎表現(xiàn)為不同程度的脊柱畸形［7-8］。本研究結(jié)果顯示，Pax1基因表達上調(diào)2.548倍，差異顯著，經(jīng)RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)，DON作用于成骨細胞使Pax1基因表達上調(diào)，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加，以此推論DON導(dǎo)致的骨骼畸形可能與Pax1基因表達上調(diào)有關(guān)。

Runx2基因是成骨細胞內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其功能主要是促進成骨細胞的分化和抑制成骨細胞成熟，Enomoto等［9］使用 Runx2基因缺陷的小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)Runx2缺失使小鼠顱骨細胞無法分化為成骨細胞。Takeda等［10］使用轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)，Runx2可以促使軟骨細胞發(fā)育成熟，使用顯性負突變的DNRunx2抑制了軟骨細胞的成熟。本研究顯示DON處理后Runx2基因表達下調(diào)2.269倍，且小鼠成骨細胞內(nèi)Runx2基因隨著DON濃度的增加，表達量明顯降低。小鼠成骨細胞在DON的影響下，周期分布改變，凋亡率增加，Runx2基因表達下調(diào)，可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)骨骼畸形，為今后DON致畸的研究以及臨床治療提供了理論依據(jù)。

差異表達基因信號傳導(dǎo)通路分析結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)已知的與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的BMP信號通路，而癌癥發(fā)生通路富集基因最多，共有15個差異基因，幾個重要的與骨骼發(fā)育、成骨細胞分化等有關(guān)的基因如PRKCA、FGF、WNT10B和MAPK8均為下調(diào)基因，說明DON影響許多相關(guān)基因的共同改變才可以產(chǎn)生細胞表型效應(yīng)。該信號傳導(dǎo)通路在DON致骨骼畸形中的作用機制有待深入研究。

其中P53作為抑癌基因，P53蛋白在調(diào)節(jié)細胞增殖、DNA修復(fù)和凋亡等過程中起關(guān)鍵作用。有研究表明P53與調(diào)節(jié)成骨細胞分化、骨骼形成有關(guān)，P53通過DNA結(jié)合依賴的最小啟動，抑制osterix的轉(zhuǎn)錄，P53缺失小鼠增加巨噬細胞集落刺激因子，有利于成骨細胞的分化［11］。本研究表明，DON影響P53信號途徑中共涉及8個基因，6個上調(diào)基因，只有STEAP3和PTEN為下調(diào)基因，在上調(diào)基因中Gadd45b，差異近2倍，為已知的P53應(yīng)答基因，其產(chǎn)物過表達引起細胞周期在G1期停滯。下調(diào)2.2倍的PTEN基因10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物，是一個重要的抑癌分子，位于10q23.3，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為515 k b的mRNA。其蛋白產(chǎn)物有一酪蛋白磷酸酶的功能區(qū)和約175個氨基酸左右的與骨架蛋白tenasin，auxilin同源的區(qū)域。PTEN基因可能通過去磷酸化參與細胞調(diào)控。其可能與酪氨酸激酶競爭共同的底物，在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展中起重要作用。P53蛋白是脊柱動物DNA損傷響應(yīng)調(diào)控因子，有研究證明，DON可導(dǎo)致DNA斷裂和損傷［12］，DNA鏈斷裂是P53依賴性細胞凋亡的誘因之一，骨組織細胞凋亡導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常。PTEN在骨代謝調(diào)控和骨穩(wěn)態(tài)維持中具有重要的作用，PTEN基因敲除導(dǎo)致骨質(zhì)硬化癥［13］。P53如何對PTEN的功能失調(diào)產(chǎn)生應(yīng)答需進一步研究。

Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)胚胎期軟骨發(fā)育，以及出生后軟骨發(fā)生、成骨細胞和破骨細胞生成、軟骨內(nèi)成骨、骨重塑、骨折修復(fù)等過程，調(diào)控骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病和骨代謝。近年研究表明，Wnt通路在人類胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生、骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［14］。其通過在細胞分化不同階段的正向和負向調(diào)控機制，保證了軟骨細胞在特定位置以合適的速率穩(wěn)定有序分化。在Wnt家族及其作用途徑的相關(guān)信號分子中，無論何種分子和亞型的異常表達都可能破壞Wnt系統(tǒng)維系的正負平衡機制，導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)畸形。本研究發(fā)現(xiàn)，DON致胎鼠畸形骨骼組織中Wnt信號的改變涉及10個基因，其中5個上調(diào)，5個下調(diào)，重要的基因Wnt10b下調(diào)1.7倍，有研究表明Wnt10b的信號抑制脂肪細胞并刺激造骨細胞生長，即減少脂肪，增加骨骼［15］。實驗發(fā)現(xiàn)，骨髓中Wnt10b的高水平表達能直接增加小鼠骨頭的密度和重量。且研究確定出調(diào)節(jié)骨骼形成的Wnt家族中的一種特殊信號蛋白的功能。

總之，我們首次通過cDNA基因芯片高通量的篩選DON引起小鼠骨骼組織差異表達基因。本研究通過對上述差異基因的通路分析，經(jīng)DAVID database數(shù)據(jù)庫篩選共涉及通路153條，其中與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的共8條，并對其與骨骼發(fā)育過程中的相關(guān)關(guān)系進行分析，探討DON可引起骨骼畸形通路的相關(guān)基因及其功能，為深入研究DON引起骨骼畸形的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Differential gene expression and related pathways of skeletal malformations induced by deoxynivalenol in mice

LI Yan，ZHAO Yinghui，ZHUANG Dongming，LI Xiaoxia，YU Ailian*
（School of Basic Medicine Sciences， Taishan Medical University， Tai’an 271000， Shandong， China）

目的： 篩選脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）致小鼠胚胎畸形骨骼組織的差異表達基因及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，從基因水平上闡明DON致小鼠骨骼畸形的分子基礎(chǔ)。方法：取孕期小鼠30只，隨機分成3個不同濃度DON染毒組、溶劑對照組和空白對照組，每組6只，將DON染毒組孕鼠于孕期第7～10天連續(xù)腹腔注射DON，染毒后第18天麻醉剖腹取出胎鼠骨骼組織，提取椎骨骨骼組織總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄法獲取畸形骨骼組織和正常對照組骨骼組織的cDNA，并對其分別進行熒光標(biāo)記，采用全基因組芯片技術(shù)對小鼠胚胎畸形骨骼組織與正常對照組織的差異基因表達譜進行分析，采用基因本體學(xué)分析軟件對差異表達基因進行功能分析，DAVID database數(shù)據(jù)庫篩選差異表達基因涉及的信號通路，并利用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對基因芯片結(jié)果進行驗證。結(jié)果：在DON染毒組小鼠全基因組芯片上篩選出差異基因282個，其中下調(diào)148個，上調(diào)134個；在差異表達基因分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)差異表達基因涉及到的通路有153個。qPCR結(jié)果表明，上調(diào)基因Fbn1、Co19a2、Papss2、Pax1F和下調(diào)基因Runx2、Pthlh等6個差異表達基因的相對定量結(jié)果與基因芯片檢驗結(jié)果表達趨勢一致。結(jié)論：應(yīng)用基因表達譜芯片初步篩選出DON所致胎鼠畸形骨骼與正常胎鼠骨骼組織中的差異表達基因，并通過通路分析發(fā)現(xiàn)，上述差異表達基因涉及多條信號傳導(dǎo)通路。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；骨骼畸形；基因芯片；差異表達基因；傳導(dǎo)通路

OBJECTIVE:To screen the differential gene expression and related pathways of fetal skeletal malformations induced by deoxynivalenol（DON） in mice，and to explore the mechanism of deformities induced by DON at the molecular level.METHODS：30 pregnant mice were randomly divided into 3 experimental groups and 2 control groups，6 in each group. DON injection was performed from days 7 to 10 of pregnancy by intraperitoneal injection into pregnant mice. At GD 18，all mice were killed under isoflurane anesthesia，and vertebral bone tissue of fetuses were collected. Total RNA of vertebral bone tissues was extracted and cDNA was obtained by RT-PCR. Using whole genome microarray technology，the gene expression profiles and the pathways of the rat vertebral bone tissue were studied. Analysis of the function of differentially expressed genes was performed by using software of gene ontology. Screening signaling pathways of differentially expressed genes was done by DAVID database. The results were verified by fluorescence quantitative PCR（qPCR） technology.RESULTS：Microarray analysis showed that 282 genes，including 148 downregulated and 134 up-regulated genes，were abnormally expressed in fetal vertebral bones after maternal DON exposure. 153 pathways were related to the differentially expressed genes. The relative quantitative results of qPCR were consistent with the results of gene chip test in Fbn1，Co19a2，Papss2， Pax1，Runx2 and Pthlh genes.CONCLUSION：There were differential gene expressions in deformed fetal skeleton between deoxynivalenol-treated rats and normal rats，involving multiple signaling pathways. The differentially expressed genes and signaling pathways may be related to themolecular mechanisms of deformities induced by DON.

deoxynivalenol；skeletal d eformities；gene c hip；differentially e xpressed g enes；signaling p athways

Q344*.13

A

1004-616X（2015）01-0001-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.001

2014-05-11；

2014-01-06

山東省科技攻關(guān)項目（2007GG30002016）；國家傳染病重大專項合作項目（2009ZX10004-216）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2013HL060）

作者信息：李巖，E-mail：liyan2313935@163.com。*通信作者，于愛蓮，E-mail:alyu@tsmc.edu.cn