段文秀，胡　玲,2，吳子建,2，龔長萍，許　靜，李前輝，王　潔,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥　230038)

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單一方式復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的特點(diǎn)與局限性分析

段文秀1，胡玲1,2，吳子建1,2，龔長萍1，許靜1，李前輝1，王潔1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]單一方式復(fù)制的膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)動(dòng)物模型主要包括自發(fā)性KOA動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)性KOA動(dòng)物模型。自發(fā)模型包括自然發(fā)生模型和轉(zhuǎn)基因模型。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)性KOA模型主要包括化學(xué)模型和機(jī)械模型。每種模型復(fù)制方法均存在一定的優(yōu)勢和不足，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)需要選擇適宜的動(dòng)物和適當(dāng)?shù)哪Ｐ蛷?fù)制方法，并對模型復(fù)制方法進(jìn)行反復(fù)操作，必要時(shí)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對模型復(fù)制方法進(jìn)行改良。

[關(guān)鍵詞]膝骨性關(guān)節(jié)炎；動(dòng)物模型；單一方式

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種累及膝關(guān)節(jié)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)障礙。隨著人口老齡化的推進(jìn)，人口結(jié)構(gòu)特征的改變，KOA的發(fā)病人數(shù)也呈遞增趨勢，這種發(fā)病趨勢將給社會帶來巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。創(chuàng)傷、機(jī)械因素、炎癥都會引起KOA。此外年齡、代謝異常以及內(nèi)分泌疾病等也可能影響KOA的進(jìn)展。關(guān)節(jié)軟骨退行性病變是KOA病理改變的核心環(huán)節(jié)。此外，病理改變還涉及到軟骨下骨、關(guān)節(jié)囊、滑膜、滑液等。KOA動(dòng)物模型的復(fù)制可以分為單一方式模型和復(fù)合模型。單一方式模型應(yīng)用廣泛，筆者綜述近年來單一方式復(fù)制KOA動(dòng)物模型研究的概況，分析其造成KOA的機(jī)制，并對不同模型的特點(diǎn)及其局限性進(jìn)行探討。

單一方式復(fù)制的KOA動(dòng)物模型主要包括自發(fā)性KOA動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)性KOA動(dòng)物模型。自發(fā)模型包括自然發(fā)生模型和轉(zhuǎn)基因模型。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)性KOA模型主要包括化學(xué)模型和機(jī)械模型?；瘜W(xué)模型是通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物或者全身給藥方式引起關(guān)節(jié)內(nèi)成分代謝發(fā)生改變來誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨改變。機(jī)械模型通過手術(shù)和關(guān)節(jié)固定改變關(guān)節(jié)應(yīng)力分布，并通過引起滑液成分改變的機(jī)制誘發(fā)關(guān)節(jié)退行性病變。

1自發(fā)性模型

自發(fā)性模型指基本在自然條件下獲得，未經(jīng)過刻意的人工處理的KOA模型，包括自然發(fā)生模型和轉(zhuǎn)基因模型。

1.1自然發(fā)生的KOA模型一些實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，如豚鼠、敘利亞倉鼠、狗和非人靈長類動(dòng)物可以形成自發(fā)KOA，以Hartley豚鼠模型應(yīng)用較多。McDougall等[2]研究發(fā)現(xiàn)Hartley豚鼠約3個(gè)月可在脛骨平臺中間形成對稱的病灶。梁震等[3]研究發(fā)現(xiàn)雌性Hartley豚鼠90 d時(shí)其關(guān)節(jié)軟骨有中度以上的損害，210 d的豚鼠關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)一步被破壞，有明顯的KOA表現(xiàn)。

1.2轉(zhuǎn)基因模型由于小鼠的基因及可標(biāo)記基因已被很好的注釋、翻譯，因此，KOA的轉(zhuǎn)基因模型常選用小鼠。KOA的轉(zhuǎn)基因模型的一些范例包括STR/ORT小鼠，其表現(xiàn)出增加的氧化應(yīng)激以至誘導(dǎo)KOA[4]。過量的組織蛋白酶K會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的缺陷，基質(zhì)金屬-13的表達(dá)也可以誘導(dǎo)軟骨破壞[5]。Salminen等[6]研究發(fā)現(xiàn)Del1轉(zhuǎn)基因小鼠3個(gè)月時(shí)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨形成表淺原纖維，繼而引起軟骨硬化、半月板退變及軟骨下骨裸露等KOA病變。

自發(fā)性KOA動(dòng)物模型成功率高，軟骨形態(tài)學(xué)改變與年齡和體質(zhì)量相關(guān)聯(lián)，病理改變過程最接近人類KOA的自然過程。該模型在研究KOA的病因及軟骨病理改變等方面有優(yōu)勢。自發(fā)性模型常以鼠類為模型動(dòng)物，而在研究KOA鼠模型時(shí)應(yīng)注意，鼠的關(guān)節(jié)幾何形狀與人類稍有不同；另外鼠類關(guān)節(jié)軟骨不含硫酸角質(zhì)素，而人類關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)此物質(zhì)隨年齡而增多，以鼠類為KOA模型動(dòng)物時(shí)，在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮該方面的差異。轉(zhuǎn)基因模型主要以小鼠模型為主，小鼠與人類的基因譜差異較大，因而并不能完全模擬人類KOA。且小鼠只能獲取少量組織學(xué)標(biāo)本，不利于對其進(jìn)行組織學(xué)的研究。自發(fā)性模型發(fā)展緩慢，時(shí)間周期較長，價(jià)格較高等也是限制其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的因素。

2誘導(dǎo)性KOA模型

誘導(dǎo)性KOA模型主要包括化學(xué)模型和機(jī)械模型。其中，化學(xué)模型的誘導(dǎo)方式可分為關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物和全身給藥。機(jī)械模型的誘導(dǎo)方式有關(guān)節(jié)外手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)和關(guān)節(jié)固定術(shù)。

2.1化學(xué)模型化學(xué)模型的復(fù)制方法包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物和全身給藥。其通過藥物直接或間接作用于關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)制引起KOA。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的藥物主要有木瓜蛋白酶和膠原酶；全身給藥的常用藥物為喹諾酮類抗生素。

2.1.1木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶通過水解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖，分離硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等機(jī)制直接對關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行損傷。Patel等[7]將0.2 mL的4%木瓜蛋白酶與0.1 mL的0.03 mmol/L半胱氨酸在關(guān)節(jié)內(nèi)3次注射(第1、4、7天)以誘導(dǎo)KOA。韓冠英等[8]用不同濃度的木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸構(gòu)成的混合溶液注入兔膝骨關(guān)節(jié)腔內(nèi)，制備出病理表現(xiàn)嚴(yán)重程度不同的兔KOA模型。段文秀等[9]用0.15 mL的木瓜蛋白酶溶液與左旋半胱氨酸混合溶液注入SD大鼠膝關(guān)節(jié)腔，4周后造成早期骨關(guān)節(jié)炎模型。孫魯寧等[10]在實(shí)驗(yàn)第1天抽取0.1 mL的4%木瓜蛋白酶溶液注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并在實(shí)驗(yàn)的第4天和第7天按照同樣的方式重復(fù)注射，以此復(fù)制兔KOA模型。

2.1.2膠原酶膠原酶通過特異性地水解天然膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)的機(jī)制直接破壞關(guān)節(jié)軟骨。鄧宇等[11]將0.5 mL的Ⅱ型膠原蛋白酶溶液注入兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)復(fù)制兔KOA模型。Botter SM等[12]將10 μL Ⅶ型膠原酶注射小鼠膝關(guān)節(jié)誘導(dǎo)出KOA模型，以此來觀察軟骨下骨表型的差異如何影響軟骨損傷的發(fā)展。

2.1.3喹諾酮類抗生素在動(dòng)物生長階段，將喹諾酮類抗生素全身給藥，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)和肌腱病。在犬發(fā)育階段，喹諾酮給藥可以造成關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖、軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的不可逆損失，表現(xiàn)為步態(tài)紊亂[13]。在幼年豚鼠，喹諾酮類抗生素全身給藥后，關(guān)節(jié)軟骨上層的退行性病變在第1天即被檢測到。但是，深層組織不容易受到影響[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中較常用到的喹諾酮類抗生素為恩諾沙星。

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物主要是通過藥物對細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖降解作用，破壞膠原纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，使得軟骨細(xì)胞因失去細(xì)胞外基質(zhì)保護(hù)而退變、凋亡，最終導(dǎo)致整個(gè)軟骨被破壞。木瓜蛋白酶和膠原酶均直接對膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，不同之處在于木瓜蛋白酶水解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖，而膠原酶水解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白。喹諾酮類抗生素是通過全身代謝變化的改變引起膝關(guān)節(jié)的退行性病變。KOA化學(xué)模型的復(fù)制操作簡單，復(fù)制模型的周期短，成功率高，模型病理改變程度與藥物濃度密切相關(guān)。相比于全身給藥方式，關(guān)節(jié)內(nèi)注射方式更為方便有效，在KOA病理改變及治療的研究中應(yīng)用較多。但使用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物方法進(jìn)行模型復(fù)制時(shí)，要注意不同的藥物濃度會造成軟骨不同程度的損傷，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的藥物濃度。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物在操作過程中針頭易劃傷軟骨組織。此外，在實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的分析中需要考慮到藥物的代謝規(guī)律及炎性因子含量與時(shí)間之間的變化關(guān)系。

2.2機(jī)械模型主要包括關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)、關(guān)節(jié)外手術(shù)以及關(guān)節(jié)固定法。主要是通過對膝關(guān)節(jié)的生理結(jié)構(gòu)、血液循環(huán)或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行干預(yù)的機(jī)制來誘導(dǎo)KOA。

2.2.1關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)方法主要有Hulth法、前交叉韌帶切除術(shù)、切除半月板術(shù)、韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。其通過破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定組織，引起關(guān)節(jié)壓力負(fù)荷傳遞不均衡的機(jī)制引起KOA。

(1)Hulth法由Hulth等[15]在1970年提出，切除膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板、前后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶后，膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，力學(xué)作用下誘使關(guān)節(jié)軟骨損害。Pfander等[16]用Hulth法誘導(dǎo)兔KOA模型來觀測低功率密度的激光對實(shí)驗(yàn)軟骨損傷兔膝關(guān)節(jié)的影響。方銳等[17]用Hulth法構(gòu)建兔KOA模型，模型復(fù)制6周即可見骨關(guān)節(jié)炎早期改變。湯曉晨等[18]用Hulth法對家兔膝關(guān)節(jié)進(jìn)行手術(shù)，并于術(shù)后7 d驅(qū)趕家兔，8周后觀察到軟骨明顯變性。

(2)前交叉韌帶切除術(shù)切斷前交叉韌帶手術(shù)創(chuàng)傷小，操作相對簡單。Hung LJ等[19]將前交叉韌帶切斷建立起兔KOA模型。袁雪凌等[20]將新西蘭大白兔前交叉韌帶切除，手術(shù)4周后可觀察到軟骨退變，術(shù)后12周軟骨嚴(yán)重退變。劉建湘等[21]對大鼠行前交叉韌帶切除術(shù)，通過對軟骨進(jìn)行病理觀察、評分，確定成功建立起大鼠KOA模型。

(3)切除半月板術(shù)半月板切除后通過破壞膝關(guān)節(jié)的正常運(yùn)動(dòng)力學(xué)軸線，使關(guān)節(jié)局部承受的壓力增大引起關(guān)節(jié)軟骨退變。李忠等[22]切除小型豬雙膝的外側(cè)半月板，術(shù)后12周觀察股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨變性。朱彤等[23]切除兔內(nèi)側(cè)半月板，同時(shí)用骨鉆對股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨面進(jìn)行破壞，這種模型復(fù)制方式將膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)力學(xué)軸線改變與軟骨的直接破壞相結(jié)合，建立起兔KOA動(dòng)物模型。

(4)韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)謝靖等[24]切斷小鼠內(nèi)側(cè)副韌帶，用微小針頭鉤出內(nèi)側(cè)半月板并切除，成功建立了一種微創(chuàng)方式誘導(dǎo)小鼠發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型。王云峰等[25]用此方法對家兔進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后14周觀察到極晚期骨關(guān)節(jié)炎改變。馬文明等[26]切斷SD大鼠膝前交叉韌帶并切除內(nèi)側(cè)半月板，術(shù)后10周對關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行肉眼和光鏡下觀察，可見重度關(guān)節(jié)軟骨退變改變。

關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)法通過手術(shù)方法破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定組織，引起關(guān)節(jié)壓力負(fù)荷傳遞不均衡，軟骨基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)將遭到破壞，軟骨細(xì)胞因失去保護(hù)作用而受損，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變。隨著關(guān)節(jié)活動(dòng)的持續(xù)，會出現(xiàn)病程的進(jìn)一步改變，可見軟骨下骨裸露，軟骨下骨質(zhì)骨折、壞死，關(guān)節(jié)面及周圍的骨質(zhì)增生等。關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)方法多樣，其中Hulth法為經(jīng)典法，但其創(chuàng)傷大，手術(shù)感染發(fā)生率高。前交叉韌帶切除術(shù)、半月板切除及前交叉韌帶切除術(shù)加半月板切除術(shù)均是在Hulth法基礎(chǔ)上作出的變通與改良，相比于Hulth法，這些手術(shù)創(chuàng)傷較小，出血、炎癥及感染情況也有降低。關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)KOA模型誘導(dǎo)方法其力學(xué)機(jī)制與人類KOA相似，模型的可復(fù)性強(qiáng)，病理改變與時(shí)間相關(guān)，隨著時(shí)間的延長，病理改變逐步加重。但關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)操作較為復(fù)雜，在手術(shù)過程中存在出血、炎癥、感染等因素的影響，因此需要操作者清晰地了解膝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)，掌握熟練的操作手法，還要求實(shí)驗(yàn)室具備較好的實(shí)驗(yàn)條件。

2.2.2關(guān)節(jié)外手術(shù)關(guān)節(jié)外手術(shù)包括血管結(jié)扎和切除卵巢法。其通過影響下肢血液循環(huán)或激素代謝改變引發(fā)KOA。

(1)血管結(jié)扎黃肖華等[27]雙重結(jié)扎兔股靜脈，術(shù)后8周觀察可見兔膝關(guān)節(jié)軟骨早中期病理改變。賀文楠等[28]用結(jié)扎兔股靜脈結(jié)合切斷腓腸肌的方法將血管結(jié)扎與力學(xué)改變兩種因素的作用進(jìn)行疊加，建立起兔KOA模型。術(shù)后12周觀察到晚期KOA改變。戴七一等[29]對兔下肢靜脈進(jìn)行結(jié)扎，8周后可見關(guān)節(jié)軟骨明顯缺損及骨贅形成等早中期骨關(guān)節(jié)炎病理改變。

(2)卵巢切除絕經(jīng)后婦女雌激素缺乏會增加KOA的風(fēng)險(xiǎn)[30]。因此，要研究KOA的這個(gè)潛在原因，需要復(fù)制卵巢切除致雌激素缺乏的KOA動(dòng)物模型。成熟大鼠卵巢切除后骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型已經(jīng)被證明與人類絕經(jīng)后骨關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)類似[31]。劉振峰等[32]采用卵巢切除法復(fù)制大鼠KOA模型。

下肢血管結(jié)扎法會造成靜脈回流受阻，骨內(nèi)靜脈瘀滯會引起骨內(nèi)高壓。骨內(nèi)高壓的持續(xù)狀態(tài)使軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-3增多，軟骨基質(zhì)中膠原蛋白和蛋白多糖分解增加，軟骨損傷、退變；同時(shí)骨內(nèi)高壓使軟骨下骨發(fā)生壞死，軟骨下骨硬度增加，因而軟骨下骨震蕩吸收能力下降，在力學(xué)作用下，進(jìn)一步加重軟骨損傷[33]。血管結(jié)扎法作用于關(guān)節(jié)外，不產(chǎn)生關(guān)節(jié)內(nèi)創(chuàng)傷及感染，但其更適合于探討與下肢血液循環(huán)障礙相關(guān)的KOA的研究。通過切除卵巢方式復(fù)制的KOA模型更適合于絕經(jīng)后婦女KOA的相關(guān)研究。因此，關(guān)節(jié)外手術(shù)模型具有特定的適用的研究類型，應(yīng)用的廣泛性較差。

2.2.3關(guān)節(jié)固定法關(guān)節(jié)固定法通過影響關(guān)節(jié)滑液的滲透作用的機(jī)制引起KOA。Haqiwara Y等[34-35]將大鼠的單側(cè)膝關(guān)節(jié)用螺釘和一個(gè)硬質(zhì)塑料板剛性固定在150°的彎曲，來誘導(dǎo)KOA模型。Maldonado DC等[36]將Wistar大鼠膝關(guān)節(jié)固定在屈曲90°的位置，8周后發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退變。唐進(jìn)等[37]用管型石膏將兔后膝關(guān)節(jié)伸直位固定6周后，觀察發(fā)現(xiàn)股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨表面有早期退行性病變。

關(guān)節(jié)固定法通過對膝關(guān)節(jié)的制動(dòng)，直接影響關(guān)節(jié)滑液的滲透作用，使得關(guān)節(jié)軟骨營養(yǎng)不足，且喪失了對滑膜炎癥的屏障作用，引起關(guān)節(jié)軟骨破壞。膝關(guān)節(jié)固定會造成膝關(guān)節(jié)周圍韌帶和肌肉的攣縮，致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定。此外固定還影響周圍血液循環(huán)形成骨內(nèi)高壓，加劇軟骨損傷。關(guān)節(jié)固定法操作較為簡單，復(fù)制的KOA模型無手術(shù)創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)內(nèi)的影響，病理改變隨固定時(shí)間的延長呈進(jìn)行性加重。但其誘導(dǎo)的KOA模型不穩(wěn)定，且動(dòng)物適應(yīng)性差，模型成功率較低。此外，在固定期間不適合對KOA進(jìn)行局部治療，影響對KOA進(jìn)行的早期防治研究。

3結(jié)語

KOA動(dòng)物模型的復(fù)制方法多種多樣，采用不同的動(dòng)物和不同的方法所復(fù)制的KOA模型各有其不同的特點(diǎn)。通過對以上單一方式復(fù)制KOA動(dòng)物模型誘發(fā)KOA機(jī)制的分析，可以發(fā)現(xiàn)，雖然以上模型誘發(fā)KOA的機(jī)制各不相同，但都會引起關(guān)節(jié)軟骨損傷繼發(fā)軟骨下骨改變。相比于自發(fā)性模型，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)性模型應(yīng)用更為廣泛。但每種誘導(dǎo)方法在操作過程中均存在需要注意的地方。使用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物方法進(jìn)行模型復(fù)制時(shí)，要反復(fù)練習(xí)，在操作中盡量避免注射針頭劃傷軟骨；使用關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)方法進(jìn)行模型復(fù)制時(shí)，要求細(xì)心熟練操作并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，以減少出血、炎癥、感染等情況的出現(xiàn)；使用關(guān)節(jié)固定法進(jìn)行模型復(fù)制時(shí)應(yīng)對固定器具進(jìn)行改良，以增強(qiáng)動(dòng)物的舒適度，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不適及反抗，提高模型復(fù)制的成功率。總之，復(fù)制一個(gè)相對理想的KOA動(dòng)物模型，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行動(dòng)物的選擇、模型復(fù)制方法的選擇，并對模型復(fù)制方法進(jìn)行反復(fù)操作，必要時(shí)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對模型復(fù)制方法進(jìn)行改良。

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·綜述·

收稿日期：(2015-07-20；編輯：曹健)

通信作者：胡玲，hulingtcm@126.com

作者簡介：段文秀(1992-)，女，碩士研究生

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2015CB554504)

[中圖分類號]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.028