文∕何 瑛 林木娣 吳 騰 邢益俊

（廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司檢測中心）

牛奶富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，被稱為“白色血液”，是為數(shù)不多的全價食品之一，也是微生物生長繁殖的良好培養(yǎng)基，一旦與外界接觸就極易受到污染，細菌總數(shù)是其衛(wèi)生質(zhì)量的重要監(jiān)控指標(biāo)。

國標(biāo)GB 19301—2010規(guī)定，當(dāng)生乳中細菌總數(shù)達到2×106CFU/mL時，牛奶的質(zhì)量安全就會受到威脅，此時生乳不允許用作原料乳。生乳的細菌總數(shù)與乳制品后期生產(chǎn)加工及儲存密切相關(guān)，細菌總數(shù)過多，生乳容易發(fā)生酸敗，導(dǎo)致保質(zhì)期縮短、蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性下降而無法加工或者在加工過程中需要更苛刻的條件才能達到滅菌效果，不僅破壞了牛奶的營養(yǎng)成分，還可能由于滅菌不完全帶來潛在質(zhì)量問題。此外，生乳中大量的細菌生長繁殖極易產(chǎn)生耐熱性的酶及毒素，它們經(jīng)超高溫處理后仍有殘留，容易引起UHT產(chǎn)品在貨架期內(nèi)變質(zhì)或?qū)е孪M者中毒事件發(fā)生[1]。

檢測生乳中細菌總數(shù)的方法很多，傳統(tǒng)的平板計數(shù)法是應(yīng)用最廣泛的，但該法需48 h才能完成菌落計數(shù)，不能及時把握原料乳的衛(wèi)生質(zhì)量狀況。近年來，細菌總數(shù)的快速檢測技術(shù)得到了很大的發(fā)展，如電化學(xué)阻抗法[2]、ATP生物發(fā)光法[3]、流式細胞計數(shù)法[4]、還原法[5]、微生物自動檢測儀等[6]。Soleris實時光電微生物快速檢測系統(tǒng)是一種新興的微生物自動檢測技術(shù)，它基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基理論和染色技術(shù)，并結(jié)合了光電檢測技術(shù)和計算機控制的模塊化分析系統(tǒng)研發(fā)而成，被UPS推薦為替代傳統(tǒng)平板的有效方法之一，在國外已成功應(yīng)用于液態(tài)奶中微生物的檢驗[7]。本文參照國標(biāo)GB 4789.2—2010方法和Soleris方法進行同步實驗，研究建立Soleris系統(tǒng)快速檢測生乳中細菌總數(shù)的方法模型，為生乳細菌總數(shù)的測定提供了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生乳

采自廣東、福建、廣西等地的大型奶牛場。

1.1.2 試劑

平板計數(shù)瓊脂（PCA，北京陸橋），0.85%滅菌生理鹽水，Soleris細菌總數(shù)試劑瓶（美國Neogen公司）。

1.1.3 儀器設(shè)備

移液槍（德國Brand），渦旋振蕩器（海太牌），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）；

Soleris實時光電微生物快速檢測系統(tǒng)，美國Neogen公司生產(chǎn)，可內(nèi)置128個試劑瓶，光電檢測器每隔6 min監(jiān)測試劑瓶底部瓊脂栓的顏色變化并傳輸?shù)接嬎銠C。

1.2 方法建立

1.2.1 工作原理

Soleris系統(tǒng)在預(yù)制的試劑瓶中放入營養(yǎng)培養(yǎng)基（內(nèi)含以葡萄糖為碳源的蛋白胨酵母抽提物）和pH值指示劑（溴甲酚紫），在35℃培養(yǎng)環(huán)境下，樣品中的細菌在Soleris試劑瓶中增殖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使pH值改變，繼而引起指示劑顏色的變化，通過系統(tǒng)自帶的光電系統(tǒng)監(jiān)測試劑瓶底部瓊脂栓顏色發(fā)生改變的時間來計算樣品的細菌數(shù)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

本實驗將取自各地牧場的細菌數(shù)各異的生乳樣品，按照GB 4789.2—2010的方法[8]選擇合適的稀釋度進行平板培養(yǎng)，同時取1 mL樣品原液加入Soleris菌落總數(shù)檢測試劑瓶中，上機檢測。國標(biāo)方法獲得樣品細菌總數(shù)（CFU/mL），Soleris儀器獲得相應(yīng)的瓊脂栓變色時間（DT），由此建立細菌總數(shù)和DT之間的對應(yīng)關(guān)系，剔除偏離回歸曲線較大的點，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線用于樣品的定量檢測。

1.2.3 儀器重復(fù)性試驗

選取細菌數(shù)在不同數(shù)量級的樣品，標(biāo)號為A1～A9，使用Soleris系統(tǒng)分別重復(fù)測定3 次，將得到的結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差用RSD表示。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證

調(diào)試儀器處于正常的檢測狀態(tài)，隨機選取不同時期各奶牛場的生乳樣品不少于30個，同時按照Soleris儀器法和國標(biāo)平板計數(shù)法對樣品細菌總數(shù)進行檢測，記錄儀器檢出時間（DT），將DT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到儀器菌落數(shù)，與對應(yīng)的平板法菌落總數(shù)進行比較，并對2 組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取來自廣東、福建、廣西等地牧場的生乳樣品共102個，將樣品在Soleris儀器上測得的指示劑變色時間（DT）設(shè)為橫坐標(biāo)，國標(biāo)平板計數(shù)法測得的細菌總數(shù)結(jié)果（CFU/mL）取對數(shù)值（Log CFU）后設(shè)為縱坐標(biāo)，得到Log CFU與DT值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

對Soleris儀器法與國標(biāo)法的結(jié)果進行回歸分析，得到生乳細菌總數(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Log CFU＝7.634－0.472×DT，相關(guān)系數(shù)R2＝－0.93，表明2 種方法所得結(jié)果具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為負數(shù)，即細菌數(shù)與DT值為負相關(guān)，細菌數(shù)越高檢測時間越短，有利于加快企業(yè)對高污染生乳樣品的預(yù)警。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，國標(biāo)生乳細菌總數(shù)的限量水平為2×106CFU/mL，DT值約為2.8 h；若設(shè)定生乳細菌總數(shù)低于5×105CFU/mL，DT值約為4.1 h；當(dāng)生乳細菌數(shù)低至103CFU/mL[1]時，DT值約為9.8 h，同國標(biāo)方法完成菌落計數(shù)所需48 h相比，Soleris方法可以大大縮短檢測時間。

圖1 生乳細菌總數(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 Soleris 儀器法重復(fù)性實驗

隨機選取生乳樣品9個，編號為A1～A9，使用Soleris系統(tǒng)分別重復(fù)測定3 次，得到的數(shù)據(jù)見表1。該方法測得數(shù)據(jù)的RSD值均在5%以內(nèi)，表明儀器檢測結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證

為了驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線的合理性，隨機抽取各奶牛場生乳樣品51 批次進行Soleris儀器法檢測，得出DT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出細菌總數(shù)，同時進行國標(biāo)法平板計數(shù)，驗證結(jié)果見表2。由于微生物檢測存在一定的誤差，2 種方法測得結(jié)果的對數(shù)值可接受偏差范圍為±0.5，由表2可以看出，2 組對數(shù)值偏差的絕對值均小于0.5。認為標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度達到檢測要求；對2 組細菌總數(shù)作t檢驗，t＝1.869＜t0.05/2.50=2.009（P＜0.05），表明2 組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，Soleris法可以滿足生乳中細菌數(shù)檢測的定量要求。

3 總結(jié)

表1 儀器法重復(fù)性實驗（n ＝3）

3.1 本實驗建立了Soleris儀器法快速檢測生乳中細菌總數(shù)的方法模型，該方法操作簡便、實時快速，可進行批量檢測，與國標(biāo)法有較好的一致性，重復(fù)性良好且自動化程度高，能有效避免人為誤差，對于生乳細菌總數(shù)檢測具有良好的適應(yīng)性，為企業(yè)快速評估生乳的衛(wèi)生質(zhì)量狀況、指導(dǎo)生產(chǎn)、控制產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了決策依據(jù)。

3.2 Soleris法使用的關(guān)鍵是建立一條覆蓋面廣、具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線的相關(guān)系數(shù)不僅取決于2個方法之間的相關(guān)性，更與參與分析的樣品數(shù)量、樣品細菌數(shù)范圍、傳統(tǒng)平板計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性等因素息息相關(guān)。隨著分析樣品數(shù)量的增加，樣品細菌數(shù)范圍覆蓋5～6個指數(shù)級，標(biāo)準(zhǔn)曲線描述的2 種方法之間的關(guān)系就越可靠，因此在日常檢驗的過程中應(yīng)不斷添加新數(shù)據(jù)以完善標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.3 由于各奶牛場奶牛品種、飼養(yǎng)條件、環(huán)境衛(wèi)生等的差異，污染生乳的細菌來源復(fù)雜，不同牧場的生乳樣品菌相不盡相同，對于標(biāo)準(zhǔn)曲線的適用性也有一定的差異，當(dāng)需要檢測新來源的生乳樣品時，需要通過驗證實驗對曲線進行校正或者重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線驗證結(jié)果

[1]汪銀鋒，李素平，高騰云，等.原料乳衛(wèi)生指標(biāo)與質(zhì)量關(guān)系的研究.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（8）：147-149.

[2]易敏英，李志勇.電阻抗法快速檢測鮮牛奶中細菌總數(shù).中國乳品工業(yè)，2001，29（3）：30-31.

[3]李春艷，霍貴成，王德國，等.ATP生物發(fā)光法快速測定生乳中微生物總數(shù)的研究.食品工業(yè)科技，2008，29（7）：233-238.

[4]王寧，劉寧.流式細胞術(shù)快速檢測生乳中細菌總數(shù).食品工業(yè)科技，2007，28（9）：197-200.

[5]富鑫，田雨，管勇佳，等.生乳細菌總數(shù)檢測儀測定生乳細菌總數(shù)的應(yīng)用.食品工業(yè)科技，2012，33（2）：70-72.

[6]孔麗娜，李祖明，吳聰明，等.生乳微生物快速檢測技術(shù)研究進展.食品研究與開發(fā)，2013，34（24）：268-271.

[7] 北京安普生化科技有限公司.Soleris系統(tǒng)在乳制品微生物快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用.食品安全導(dǎo)刊，2012（7）：34-35.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.