吳秀娟，李凱航，楊顯超，王 建

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬瘟病毒5種ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的比較

吳秀娟，李凱航，楊顯超，王 建

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

[目的]比較豬瘟病毒（CSFV）5種ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的使用效果。[方法]利用細(xì)胞中和試驗(yàn)制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清，制備不同豬瘟抗體效價(jià)的陽性血清70份和陰性血清20份，對(duì)5種試劑盒的敏感性、特異性和符合率進(jìn)行比較。利用該5種試劑盒對(duì)不同年齡段豬群血清中豬瘟抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果] 5種試劑盒的敏感性為85.7%-100%，特異性均達(dá)到100%，符合率為88.9%-100%。不同年齡段豬血清樣品中，5種試劑盒檢測(cè)結(jié)果不盡相同。[結(jié)論]豬瘟抗體效價(jià)的高低對(duì)5種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性有一定影響，尤其是針對(duì)弱陽性樣品時(shí)，IDEXX豬瘟抗體試劑盒和荷蘭賽迪公司的豬瘟抗體試劑盒檢測(cè)效果相對(duì)較好，為豬瘟免疫檢測(cè)工作提供了一定依據(jù)。

豬瘟病毒；抗體檢測(cè)試劑盒；比較和應(yīng)用

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、發(fā)熱、具有高度傳染性和致死性的豬傳染病，在許多國家和地區(qū)均有發(fā)生，給畜牧生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將豬瘟列為法定通報(bào)性疾病，我國將其劃為一類動(dòng)物傳染病，并納入重大動(dòng)物疫病防控計(jì)劃。疫苗預(yù)防接種是控制該病的有效措施，并取得了良好效果。隨著CSFV疫苗的應(yīng)用，需要評(píng)價(jià)疫苗接種的免疫效果。目前，用于檢測(cè)CSFV抗體的方法主要包括細(xì)胞中和試驗(yàn)，是國際公認(rèn)的CSFV抗體檢測(cè)的經(jīng)典方法[2-3]，但該方法的敏感度和準(zhǔn)確性易受人員、試劑等諸多因素的影響，多限于實(shí)驗(yàn)室使用。臨床檢測(cè)中主要采用CSFV-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，但不同品牌試劑盒的檢測(cè)效果存在差異。因此，本研究以細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)獲得的陰性、陽性血清參考品制備標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清樣品，針對(duì)5種CSFV-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的敏感性、特異性以及符合率進(jìn)行了比較。為臨床中CSFV疫苗免疫評(píng)價(jià)和流行病學(xué)

調(diào)查提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗體檢測(cè)試劑盒

5種試劑盒編號(hào)為試劑盒A、B、C、D、E，豬瘟病毒間接ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)140401）為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；ID Screen Classical Swine Fever E2 Competition ELISA kit（批號(hào)626）購自上海典諾生物有限公司；IDEXX Classical Swine Fever Virus （批號(hào) B801）購自上海賽嘉生物有限公司；BioChek Classical Swine Fever Virus（CSFV-E2） Antibody Test kit （ 批 號(hào)Fs5655）購自上海贊維生物有限公司；PrioCHECK CSFV Antibody ELISA Test kit （批號(hào) N140501L） 購自荷蘭賽迪公司。試劑盒A樣品IE值=樣品OD450 /標(biāo)準(zhǔn)品陽性對(duì)照平均值OD450×100%，其值大于或等于10%時(shí)，判定為豬瘟抗體陽性。試劑盒B樣品S/N%值=樣品OD450 /標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照平均值OD450×100%，其值小于或等于50%，判定為豬瘟抗體陽性。試劑盒C樣品Blocking%值=（標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照平均值OD450－樣品OD450）/標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照平均值OD450，其值大于或等于40%，就判定為豬瘟抗體陽性。試劑盒D樣品S/P值=（樣品OD值－陰性對(duì)照平均OD值）/（陽性對(duì)照平均OD值－陰性對(duì)照平均OD值），其值大于或等于0.5，就判定為豬瘟抗體陽性。試劑盒E樣品PI值=（1－樣品OD450 / 標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照平均值OD450）×100%，其值大于或等于40%，就判定為豬瘟抗體陽性。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清

豬瘟病毒陰性和陽性血清（細(xì)胞中和試驗(yàn)）參考品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。陰性血清批號(hào)為S0760905-1。陽性血清批號(hào)為S0760905-3，其標(biāo)定定值的細(xì)胞中和效價(jià)分別為1:（2138±2）。通過對(duì)參考品進(jìn)行稀釋，共獲得20份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，70份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，陽性血清中豬瘟抗體的效價(jià)為1:1000，1:500和 1:250的強(qiáng)陽性血清各10份；1:100， 1:50和1:25的中等陽性血清各10份；1：10的弱陽性血清10份。制備的標(biāo)準(zhǔn)血清樣品用于ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)。

1.3 試劑盒的敏感性、特異性和符合率

采用制備好的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)5種豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)，按下列公式計(jì)算各試劑盒的敏感性、特異性和符合率。敏感性=（檢測(cè)為陽性的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陽性血清總份數(shù)）×100%；特異性=（檢測(cè)為陰性的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清總份數(shù)）×100%；符合率=（檢測(cè)為陽性和陰性的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)血清總份數(shù)）×100%。

1.4 不同年齡段豬血清樣品

收集15d、30d、50d、70d、90d、120d、150d和180d日齡豬群的血清樣品各10份，實(shí)驗(yàn)仔豬于25～30日齡完成豬瘟疫苗的首免。血清樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 5種ELISA試劑盒的敏感性、特異性和符合率的比較

采用制備好的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清20份和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清70份，對(duì)5種試劑盒平行檢測(cè)，并計(jì)算各試劑盒的敏感性、特異性及符合率，結(jié)果見表1。敏感性方面，試劑盒C和E的敏感性最好，都達(dá)到了100%。試劑盒D的敏感性為98.6%，而試劑盒A和試劑盒B的敏感性為85.7%。特異性方面，5種試劑盒的特異性都達(dá)到100%。符合率方面，試劑盒C和試劑盒E符合率達(dá)到100%，試劑盒A和B符合率為88.9%，試劑盒D符合率為98.9%。以上結(jié)果表明，這5種試劑盒在敏感性，特異性和符合率上相差并不大，其中試劑盒C和試劑盒E的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)較好。

2.2 5種ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和豬瘟抗體效價(jià)相關(guān)性研究

表1 5種試劑盒的敏感性、特異性及符合率比較

通過對(duì)細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)得到的陰性、陽性血清參考品進(jìn)行稀釋，得到的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中豬瘟抗體效價(jià)為1:1000，1:500，1:250，1:100，1:50，1:25和1：10。不同豬瘟抗體效價(jià)的陽性血清樣品各10份，利用5種試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)，結(jié)果見表2。

由檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著豬瘟抗體效價(jià)變化，5種試劑盒檢測(cè)數(shù)據(jù)有趨勢(shì)性變化。試劑盒A和B檢測(cè)臨界值位于豬瘟抗體效價(jià)1:10到1:25之間。試劑盒C和E檢測(cè)臨界值小于豬瘟抗體效價(jià)1:10。試劑盒D檢測(cè)臨界值位于豬瘟抗體效價(jià)1:10附近。

由此推斷，試劑盒C和試劑盒E在檢測(cè)豬瘟抗體效價(jià)達(dá)到1:10的樣品時(shí)，其敏感性已達(dá)到100%，而試劑盒A、B和D在檢測(cè)豬瘟抗體效價(jià)達(dá)到1:25的樣品時(shí)，其敏感性才達(dá)到100%?？梢?，試劑盒C和E的檢測(cè)精確度較好。

在豬瘟效價(jià)為1:10的弱陽性血清樣品的檢測(cè)中，5種檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果見表3。試劑盒C和E的檢測(cè)結(jié)果為100%陽性，試劑盒D的檢測(cè)結(jié)果為90%陽性，試劑盒B的檢測(cè)結(jié)果為100%陰性，而試劑盒A 的檢測(cè)結(jié)果為70%陰性，30%可疑。由此可見，在弱陽性樣品情況下，5種試劑盒檢測(cè)結(jié)果有一定的差距。

2.3 不同年齡段豬群豬瘟抗體的檢測(cè)

采自15d、30d、50d、70d、90d、120d、150d和180d日齡不同年齡段豬群的血清樣品，各10份，利用5種試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)，可疑結(jié)果計(jì)算為陰性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果見表4。15日齡豬群的10份血清樣品，5種試劑盒檢測(cè)陽性率在40%～90%之間。30日齡豬群的10份血清樣品，5種試劑盒檢測(cè)陽性率在20%～60%之間。50日齡豬群的10份血清樣品，5種試劑盒檢測(cè)陽性率在50%～100%之間。70、90、120、150日齡豬群的10份血清樣品，5種試劑盒檢測(cè)陽性率均在100%之間。180日齡豬群的10份血清樣品，5種試劑盒檢測(cè)的陽性率在70%～90%之間。由此可見，在不同年齡段豬群血清中，5種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果有所不同，尤其是在15、30、50日齡的豬群血清中。

3 討論

本研究對(duì)5種豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較顯示，它們總體在敏感性、特異性以及符合率上相差并不大，其中試劑盒C和試劑盒E敏感性和符合率達(dá)到100%，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)較好。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果和豬瘟抗體效價(jià)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，5種試劑盒的檢測(cè)臨界值有所差異。在血清樣品為弱陽性，豬瘟抗體效價(jià)較低的情況下，5種試劑盒的敏感性和符合率上也不相同，試劑盒C和E的敏感度和精確度更高。究其原因可能如下：試劑盒A、B、D和E都是采用重組表達(dá)的豬瘟病毒E2蛋白作為包被抗原包被ELISA板，但所使用的酶標(biāo)二抗有所不同。試劑盒A、B和D都是采用的兔抗豬IgG的多抗，利用間接ELISA的方法進(jìn)行檢測(cè)。而試

劑盒E采用的針對(duì)E2蛋白的單克隆抗體，利用阻斷ELISA的方法進(jìn)行檢測(cè)，由于單克隆抗體的特異性強(qiáng)，純度高，均一性好等優(yōu)點(diǎn)會(huì)使得試劑盒E在敏感性和符合率更好[4]。而試劑盒C是以豬瘟病毒抗原包被ELISA板，用阻斷ELISA原理檢測(cè)豬瘟病毒抗體，其所采用的二抗是抗豬瘟病毒的單克隆抗體，其二抗和包被抗原的結(jié)合特異性和敏感性都能夠得到保證。此外，5種試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)也有所不同，相較于A、B、和D試劑盒，試劑盒C和E判定陽性的臨界值所對(duì)應(yīng)的豬瘟抗體濃度更低。綜上所述，在血清樣品中豬瘟抗體效價(jià)低于一定量的時(shí)候，試劑盒C和E的檢測(cè)效果優(yōu)于其他試劑盒，但這兩個(gè)試劑盒之間的差異還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證明。

表2 5種試劑盒檢測(cè)結(jié)果和豬瘟抗體效價(jià)相關(guān)性研究

表3 5種試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體效價(jià)為1:10血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

表4 不同年齡段豬群豬瘟抗體5種試劑盒檢測(cè)結(jié)果

有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，豬瘟的母源抗體在32日齡會(huì)下降到50%左右，而上海地區(qū)一般給25-30日齡仔豬進(jìn)行豬瘟首次免疫[5]。因此在50日齡前，仔豬體內(nèi)主要為母源抗體，其血清中豬瘟抗體效價(jià)不會(huì)很高，所以在本研究中，5種試劑盒在15、30和50日齡豬群血清樣品中檢測(cè)結(jié)果有所差異。等到豬群達(dá)到70-150日齡之間，豬群體內(nèi)的豬瘟免疫抗體達(dá)到了一定的峰值并一直維持在較高水平，5種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果就均為100%。由此可見，5種試劑盒主要是在樣品中豬瘟抗體效價(jià)不太高的時(shí)候，檢測(cè)有所差異，等到樣品中抗體效價(jià)達(dá)到一定水平后，其檢測(cè)結(jié)果并無太大差異，提示我們實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員在檢測(cè)豬瘟抗體位于陰陽性臨界值的弱陽性樣品時(shí)，要關(guān)注不同試劑盒檢測(cè)結(jié)果可能存在差異，假陰性和假陽性的結(jié)果比例都有可能上升。本研究通過對(duì)不同豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的比較，顯示在高抗體效價(jià)情況下，5種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無明顯差距，但在低抗體效價(jià)情況下，基于阻斷ELISA方法，利用針對(duì)包被抗原的特異性單克隆抗體的兩種試劑盒檢測(cè)效果優(yōu)于其他試劑盒，更能夠客觀評(píng)價(jià)豬體血清的抗體水平，為今后豬瘟抗體檢測(cè)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

[1] Edwards S，F(xiàn)ukusho A，Lefevre P C，et al. Classical swine fever：the global situation [J]. Vet Microbiol，2000，73（2-3）：103-119

[2] OIE Biological Standards Commission．Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals（Mammals，Birds and Bees）．5th ed．Paris：Office International Des Epizooties，2004．

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告（第1125號(hào)），2008．

[4] 徐璐，范學(xué)政，徐和敏，等.豬瘟間接ELISA方法的建立和優(yōu)化[J].中國獸醫(yī)雜志.2012.48（3）：15-17.

[5] 孫泉云，夏爐明，盧軍，等.上海規(guī)模豬場(chǎng)主要豬病母源抗體消長動(dòng)態(tài)的跟蹤調(diào)查[J].畜禽業(yè)雜志. 2014.305（9）：60-61.

Comparison of 5 Antibody Detection Kits for Classical Swine Fever Virus

XiujuanWu，Kaihang Li，XianchaoYang，Jian Wang
（Shanghai animal disease control center，Shanghai 201103）

To compare 5 commercial ELISA kits for detection of CSFV sera antibody，a total of 70 samples of CSFV-positive sera at different antibody titers and 20 samples of CSFV-negative sera diluted with reference negative and positive sera against CSFV prepared via cell neutralization test were used in the tests. The results showed that the sensitivity，specifi city and coincidence rates were 85.7% to 100%，100%-100% and 88.9%-100% respectively in the 5 ELISA kits. In addition，the sera samples from different age pigs were used for the detection of the 5 ELISA kits. All the results showed that CSFV different antibody titers had some effects on the detection results of the 5 kits，especially for the weak positive samples，the detection results of the IDEXX CSFV antibody test kit and the PrioCheck CSFV antibody test kit were better.

classical swine fever virus；antibody detection kits；comparison and application

S852.651

B

1005-944X（2015）05-0078-04

滬農(nóng)科推字（2012）第3-2號(hào)；滬農(nóng)科產(chǎn)字（2015）第6號(hào)

王建