于姝媛　王　蘋　湯　勇劉柏林李曉峰(吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林　長春　3002)

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成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架促進(jìn)中耳黏膜上皮細(xì)胞的增殖

于姝媛王蘋湯勇1劉柏林1李曉峰1
(吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討植入成纖維細(xì)胞的膠原凝膠復(fù)合支架對(duì)中耳黏膜上皮細(xì)胞生長和增殖的影響。方法制備大鼠I型膠原凝膠，以7∶1∶1混合膠原、10×DMEM和新生牛血清。以1/9體積比接種成纖維細(xì)胞，構(gòu)建成纖維細(xì)胞的膠原凝膠復(fù)合支架，冰凍切片觀察成纖維細(xì)胞在凝膠中的生長形態(tài)。復(fù)合支架接種中耳黏膜上皮細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞的生長狀態(tài)，酶消化計(jì)數(shù)上皮細(xì)胞在接種的不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果接種后3 d成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，細(xì)胞的突起在兩極逐漸伸展延長。冰凍切片結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞均勻地分布于凝膠中，細(xì)胞兩極為兩個(gè)較長的突起。接種于成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架上皮細(xì)胞增殖速度明顯高于接種于單純膠原凝膠組，比較上皮細(xì)胞在復(fù)合支架接種后3 d，6 h的細(xì)胞數(shù)量明顯多于同時(shí)間點(diǎn)的膠原凝膠組(P＜0. 05，P＜0. 01)。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞在單純膠原凝膠中，集聚生長形成島型分布，在成纖維細(xì)胞/膠原復(fù)合支架上，與成纖維細(xì)胞交互分布，且細(xì)胞密度大于前者。結(jié)論植入成纖維細(xì)胞的膠原凝膠復(fù)合支架對(duì)上皮細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用。

〔關(guān)鍵詞〕膠原凝膠;成纖維細(xì)胞;上皮細(xì)胞;復(fù)合支架

1吉林省人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科

第一作者:于姝媛(1986-)，女，技士，主要從事耳科學(xué)研究。

鼓膜穿孔是耳科常見的疾病之一，常由外傷和化膿性中耳炎遷延所致。鼓膜穿孔可引起聽力下降、言語發(fā)育延遲和慢性耳瘺及膽脂瘤形成等〔1〕。目前常用的治療方法是外科鼓膜修補(bǔ)，修補(bǔ)材料大多來自自體顳肌筋膜或顳骨骨膜，盡管近期的手術(shù)成功率比較高，但由于修補(bǔ)材料與鼓膜組織結(jié)構(gòu)尚存在差異，其主要差異是修補(bǔ)材料缺少纖維層;此外，自體材料存在來源不足和機(jī)體的再損傷等原因，使鼓膜功能恢復(fù)和遠(yuǎn)期效果不理想〔2〕。目前組織工程皮膚的研究進(jìn)展使應(yīng)用此技術(shù)修復(fù)鼓膜缺損成為可能，本實(shí)驗(yàn)利用不斷完善的組織工程學(xué)技術(shù)及支架材料的開發(fā)，探索構(gòu)建組織工程化鼓膜的技術(shù)，研制組織工程化鼓膜移植物，以實(shí)現(xiàn)提高鼓膜穿孔治愈率、提高聽力功能恢復(fù)和遠(yuǎn)期療效以及減輕對(duì)患者自身機(jī)體損傷的目標(biāo)。

1　材料和方法

1. 1動(dòng)物和主要實(shí)驗(yàn)試劑Wistar大鼠(清潔級(jí))由吉林大學(xué)動(dòng)物部(動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào): 10-1026)提供。隨機(jī)選取耳廓反射正常，實(shí)驗(yàn)前清潔外耳道，顯微鏡下檢查均無中耳炎的動(dòng)物，確保動(dòng)物無噪聲暴露及藥物使用史。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、表皮生長因子(EGF)、Cell Tracker Dil等購于Invitrogen公司，CK19和Vimentin抗體購于北京博奧森生物公司。藥房，2010; 21(15): 1439-40.

1. 2中耳黏膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法參照Formanek等〔3〕文獻(xiàn)。采用10%水合氯醛按300 mg/kg劑量，腹腔注射進(jìn)行大鼠麻醉。剪開顱骨，取出聽泡，立即浸入含抗生素、預(yù)冷的D-Hank液中。無菌環(huán)境置聽泡于解剖顯微鏡下打開，用分離針剝離中耳黏膜。將黏膜移入0. 075%蛋白酶ⅩⅣ消化液中，室溫下消化1 h，移入離心管，1 000 r/min下離心10 min，棄去上清，留取細(xì)胞沉淀。用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，活細(xì)胞染色并細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞含量為5×105/ml，接種于35 mm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)1 h后，將未貼壁的細(xì)胞移入另一個(gè)培養(yǎng)皿中，加入2 ml上皮細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%FBS和20 ng/ml EGF的DMEM/F12)，剩余細(xì)胞加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM/F12)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞鑒定采用免疫熒光染色技術(shù)，CK19抗體識(shí)別上皮細(xì)胞，Vimentin抗體識(shí)別成纖維細(xì)胞。

1. 3膠原凝膠制備采用大鼠鼠尾膠原浸出法，成年大鼠鼠尾，酒精消毒，去除尾上皮膚，分離肌腱與肌肉;將肌腱在70%乙醇中浸泡30 min，切碎，無菌水沖洗;轉(zhuǎn)移至0. 1%乙酸溶液中，每根鼠尾用250ml乙酸溶液浸泡，置于4℃，48 h后取出，4 000 r/min離心30 min，取上清;加入0. 1 mol/L NaOH，按6∶1體積比混合，中和乙酸，然后1 500 r/min離心5 min，收獲沉淀;等體積稀乙酸(0. 01 mol/L)溶解沉淀，4℃保存。

1. 4成纖維細(xì)胞膠原凝膠的制備取第3代成纖維細(xì)胞，在處于對(duì)數(shù)生長期90%細(xì)胞融合時(shí)用0. 25%的胰蛋白酶消化3 min，輕輕吹打，1 000 r/min離心，重懸于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度至5×106/ml。用滅菌的0. 1 mol/L的醋酸溶液稀釋提取的鼠尾膠原濃度至0. 6%，然后與10×DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、新生牛血清按7∶1∶1的比例混勻;加入1 mol/L NaOH以中和醋酸，快速混勻，立即加入1/9劑量的成纖維細(xì)胞懸液，快速混合。將此膠原/細(xì)胞混懸液吸入培養(yǎng)皿;在37℃培養(yǎng)箱中靜置10 min，待凝膠形成后，補(bǔ)加成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液1次。

1. 5冰凍切片成纖維細(xì)胞膠原凝膠進(jìn)行冰凍切片，片厚10 μm左右。貼附于載玻片上，10%甲醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1. 6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中耳黏膜上皮細(xì)胞采用Dil標(biāo)記，以1× 105細(xì)胞/ml的濃度分別接種于膠原凝膠和成纖維細(xì)胞膠原凝膠復(fù)合支架上，持續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)后3、6 d時(shí)間點(diǎn)，消化細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17. 0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2. 1中耳黏膜細(xì)胞一般形態(tài)和鑒定中耳黏膜上皮細(xì)胞，在接種后24 h，大部分細(xì)胞貼壁，5 d細(xì)胞增殖明顯，相互融合成島狀(圖1a)。培養(yǎng)到第8天時(shí)，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，與角朊細(xì)胞相似。細(xì)胞融合成片，鋪滿培養(yǎng)皿的底部(圖1b)。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，培養(yǎng)6 d的中耳黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)CK19標(biāo)記蛋白，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1c。綠色熒光為陽性表達(dá)，藍(lán)色熒光為核復(fù)染(Heochest33342)。

中耳黏膜成纖維細(xì)胞，1 h后既有貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)為長梭形，6 d細(xì)胞集落彼此融合接近長滿單層(圖1d)。10 d細(xì)胞交叉重疊生長，但長梭形的生長形態(tài)依然良好(圖1e)。采用波形蛋白(Vimentin)免疫熒光染色鑒定成纖維細(xì)胞，Vimentin陽性表達(dá)呈現(xiàn)紅色熒光，定位于細(xì)胞質(zhì)。培養(yǎng)6 d的成纖維細(xì)胞均表達(dá)標(biāo)志蛋白Vim。

圖1　形態(tài)學(xué)觀察中耳黏膜上皮和成纖維細(xì)胞

a～c:中耳黏膜上皮細(xì)胞，d～f:中耳黏膜成纖維細(xì)胞

2. 2成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架一般形態(tài)觀察膠原凝膠形成后呈半透明狀，隨時(shí)間延長，膠原凝膠發(fā)生收縮，培養(yǎng)基中放置12 d后，膠原凝膠收縮，且膠原彈性增加。成纖維細(xì)胞，接種后約3 h可見細(xì)胞與膠原纖維發(fā)生黏著。接種后3 d，成纖維細(xì)胞數(shù)量生長迅速，細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞的兩極逐漸伸展延長。膠原凝膠中可以見成纖維細(xì)胞極性排列。接種后12 d凝膠塊收縮至原來的3/5左右，此后收縮不明顯。大約3 w后，成纖維細(xì)胞密度達(dá)到其極限，部分成纖維細(xì)胞從膠原凝膠中遷出。冰凍切片結(jié)果顯示，HE染色可見膠原凝膠呈較均一的淡紅色網(wǎng)狀分布，而成纖維細(xì)胞均勻地分布于凝膠中，呈長梭形，胞核呈橢圓形，大多數(shù)細(xì)胞兩極為兩個(gè)較長的突起，極少數(shù)細(xì)胞有較多的突起。見圖2。

圖2　成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架的HE染色

2. 3中耳黏膜上皮細(xì)胞在成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架上增殖活性變化膠原凝膠接種成纖維細(xì)胞3 d后，在細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架上接種Dil染料標(biāo)記的上皮細(xì)胞。分別在接種上皮細(xì)胞的3 d、6 d后，消化細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)紅色熒光細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，接種于成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架上皮細(xì)胞增殖速度明顯高于接種于單純膠原凝膠組，比較上皮細(xì)胞在復(fù)合支架接種后3 d、6 h的細(xì)胞數(shù)量明顯多于同時(shí)間點(diǎn)的膠原凝膠組(P＜0. 05，P＜0. 01)。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞在單純膠原凝膠中，集聚生長形成島型分布，在成纖維細(xì)胞/膠原復(fù)合支架上，與成纖維細(xì)胞交互分布，且細(xì)胞密度大于前者。見圖3。藍(lán)色熒光為Dapi標(biāo)記的成纖維細(xì)胞，紅色熒光為Dil標(biāo)記的上皮細(xì)胞，Bar=50 μm

圖3　成纖維細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合支架接種上皮細(xì)胞的激光共聚焦掃描結(jié)果(×200)

3　討論

鼓膜位于中耳鼓室和外耳道交界，是一個(gè)由上皮層、黏膜層和中間纖維層組成的半透明薄膜，具有增加傳入聲波增益的特殊傳音結(jié)構(gòu)。鼓膜損傷導(dǎo)致穿孔常見的治療方法是外科修補(bǔ)，選用自體顳骨骨膜、顳肌筋膜或耳屏軟骨膜封閉穿孔，盡管手術(shù)修補(bǔ)的成功率較高，但由于修補(bǔ)材料與鼓膜組織結(jié)構(gòu)存在差異(缺少纖維層)，鼓膜功能恢復(fù)和遠(yuǎn)期療效不理想。由于鼓膜組織形成的特殊放射狀纖維支持鼓膜的強(qiáng)度及緊張度，而大部分的穿孔愈合是假膜愈合，即只有上皮層和黏膜層，缺少成纖維細(xì)胞形成的中間纖維層，假性鼓膜仍無法補(bǔ)償聲音傳入時(shí)所產(chǎn)生的衰減。這個(gè)實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建膠原/成纖維細(xì)胞符合支架，觀察組織工程鼓膜纖維層結(jié)構(gòu)對(duì)黏膜上皮細(xì)胞生長和增殖的影響，構(gòu)建具有纖維層的完整生物工程鼓膜。

生物工程材料在外科組織修復(fù)術(shù)中有廣泛的應(yīng)用。如何根據(jù)損傷組織局部的組織學(xué)特征需用合適的工程材料是組織修復(fù)成功的關(guān)鍵。適合于鼓膜修復(fù)的工程材料首選考慮中間纖維層的形成，以保證修復(fù)成功后的鼓膜強(qiáng)度和適宜的緊張度。顧其勝〔4〕報(bào)道，膠原蛋白具有成纖維性能。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)凝膠中的成纖維細(xì)胞與膠原之間存在相互作用，有利于成纖維細(xì)胞的有序生長、增殖。成纖維細(xì)胞沿膠原纖維縱向排列，這種結(jié)構(gòu)使得纖維細(xì)胞凝膠復(fù)合支架具有一定的伸展性和彈性。

Tremblay等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，利用含成纖維細(xì)胞和不含成纖維細(xì)胞的膠原、彈性蛋白生物工程復(fù)合物進(jìn)行皮膚損傷修復(fù)，發(fā)現(xiàn)移植后含成纖維細(xì)胞的復(fù)合物降解速度要比不含成纖維細(xì)胞的慢2～4 w，證實(shí)植入的成纖維細(xì)胞可穩(wěn)定真皮纖維層。成纖維細(xì)胞可分泌EGF等上皮生長因子，促進(jìn)上皮細(xì)胞生長，而且膠原中成纖維細(xì)胞具有促真皮與表皮重組的作用。

文獻(xiàn)報(bào)道在體外培養(yǎng)時(shí)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的相互作用是通過它們分泌在培養(yǎng)基中的可溶性酸性生長因子來實(shí)現(xiàn)的。成纖維細(xì)胞既能夠分泌胰島素樣生長因子(IGF-1)，也能合成Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維黏連蛋白(FN)，F(xiàn)N成分具有促進(jìn)細(xì)胞向傷口處移動(dòng)〔6〕，成纖維細(xì)胞在組織上與過程中的作用不可缺少。

在體外培養(yǎng)過程中，成纖維細(xì)胞沿膠原纖維重新排列，接種成纖維細(xì)胞12 d后凝膠塊收縮至原來的3/5左右?？赡茉从谀z原凝膠中的成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ和Ⅲ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，這些新分泌的基質(zhì)成分使重組膠原凝膠發(fā)生纖維重構(gòu)。此外，細(xì)胞外基質(zhì)的增多可以改善膠原凝膠的生物相容性，重構(gòu)的膠原凝膠改變了膠原凝膠的韌性，使復(fù)合支架更適合上皮細(xì)胞生長。Goulet等〔7〕通過成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞間接共同培養(yǎng)的系統(tǒng)觀察成纖維細(xì)胞對(duì)上皮細(xì)胞生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，間接共培養(yǎng)系統(tǒng)明顯刺激上皮細(xì)胞的生長和增殖，上皮細(xì)胞克隆形成率增加，認(rèn)為這個(gè)間接培養(yǎng)基中存在著由成纖維細(xì)胞所分泌的生長因子促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖。Yoshikawa等〔8〕研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞可能還分泌一些其他類型與上皮細(xì)胞分化增殖信號(hào)傳導(dǎo)途徑的細(xì)胞基質(zhì)成分，這在鼓膜修復(fù)過程中的作用尚待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，在膠原凝膠中成纖維細(xì)胞具有活躍的生物學(xué)特性，使之形成有抗拉伸能力的組織工程類似鼓膜纖維層，在其表面成功接種的中耳黏膜上皮細(xì)胞具有促黏附和增殖作用，有望成為鼓膜修復(fù)的生物工程替代品。

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〔2014-11-23修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:湯勇(1973-)，男，主任醫(yī)師，主要從事耳科學(xué)研究。

基金項(xiàng)目:吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No．201015223);吉林省衛(wèi)生計(jì)生委資助課題(No．2012z094)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5703-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 021

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R764