劉鐵軍，劉健，陳硯凝，許彥枝

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

·論著·

NF-κB、Notch-1及Jagged-1在口腔扁平苔蘚中的表達及臨床意義*

劉鐵軍，劉健，陳硯凝，許彥枝

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

目的檢測NF-κB、Notch-1及Jagged-1在口腔扁平苔蘚及正?？谇火つそM織中的表達，分析三種蛋白間的相關性，探討Notch-1/NF-κB信號傳導系統(tǒng)在口腔扁平苔蘚病損形成及發(fā)展過程中的作用。方法采用免疫組化方法檢測NF-κB、Notch-1及Jagged-1在52例口腔扁平苔蘚和30例正?？谇火つそM織標本中的表達情況，并分析三種蛋白間的相關性。結果口腔扁平苔蘚組織中NF-κB、Notch-1及Jagged-1的表達均明顯高于正常口腔黏膜組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NF-κB、Notch-1、Jagged-1在口腔扁平苔蘚組織中的表達具有顯著相關性（P＜0.05）。結論Notch-1/NF-κB信號通路的異常激活對口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展有重要意義。

口腔扁平苔蘚；NF-κB；Notch-1；Jagged-1

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種常見的非感染性口腔黏膜疾病，有一定的癌變傾向[1]，該病病因不明，以往研究應用基因芯片技術篩選出的有關OLP的142個差異表達基因及其8條相關通路，其中NF-κB通路與OLP密切相關[2]。NF-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）為真核轉錄因子成員，廣泛調(diào)控多種細胞因子、趨化因子和免疫受體的表達，其活化也參與細胞增殖和凋亡過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路與一些人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，Notch-1是Notch基因家族的成員之一，研究分析其功能失調(diào)可阻止細胞分化，最終導致未分化的細胞向惡性轉化[3]。有實驗證實，NF-κB與Notch轉導通路之間存在有復雜的交聯(lián)對話作用，并構成信號轉導網(wǎng)絡，廣泛參與細胞一系列生理及病理反應過程[4]。本研究通過檢測口腔扁平苔蘚及正常口腔黏膜組織中NF-κB、Notch-1及Jagged-1的表達情況，分析NF-κB與Notch-1、Jagged-1的相關性，探討Notch-1/NF-κB信號傳導系統(tǒng)在口腔扁平苔蘚發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

病例資料：選取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔科活檢或手術切除并經(jīng)病理證實的52例口腔扁平苔蘚及30例正?？谇火つそM織。標本取出后，立即投入10%中性福爾馬林中固定，100%、85%及75%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片4μm厚，以備染色。所有組織標本均經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科確診。所選病例均未應用過非甾體抗炎藥物、未進行過放化療等治療。

1.2 主要試劑

NF-κBp65（中杉金橋公司），Notch-1及Jagged-1羊抗人多克隆抗體（SANTA CRUZ公司），P-V法免疫組織化學（免疫組化）檢測試劑盒（上?；蚬荆?/p>

1.3 免疫組化P-V法

石蠟切片常規(guī)脫蠟，水化，自來水沖洗；滴加過氧化物酶阻斷試劑，室溫下孵育10 min，PBS洗滌3次，每次3 min；在切片上分別加入NF-κB、Notch-1及Jagged-1抗體，4℃孵育過夜；滴加二抗孵育20 min，PBS洗滌3次；顯色劑顯色；蘇木素復染，PBS返藍，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片保存。以PBS代替一抗作為空白對照，以不加一抗作為陰性對照。抗體稀釋度分別為：NF-κB抗體為1∶60 Notch-1抗體為1∶100，Jagged-1抗體為1∶300。

1.4 結果判定

光學顯微鏡下，隨機選取5個高倍視野（× 400），觀察腫瘤細胞的胞漿和胞核，結合陽性細胞所占百分比和染色強度進行半定量分析，并根據(jù)染色強度按下列標準評定：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色的陽性細胞所占百分比評定：陰性為0分，陽性細胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。然后根據(jù)兩項評分相乘之積判斷結果：≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），≥6分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析，各組表達程度的比較用非參數(shù)檢驗方法，相關性采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB的表達情況

NF-κB在正常口腔黏膜組織及OLP組織中均有表達。在正?？谇火つそM，其陽性著色偶見于基底層細胞的細胞漿；在OLP組，陽性著色密集分布于基底層細胞及固有層T淋巴細胞的胞漿中，偶見細胞核中，見圖1。統(tǒng)計學分析顯示，NF-κB在OLP中的表達明顯高于正?？谇火つそM（Z=-7.709，P= 0.000），見表1。

2.2 Notch-1的表達情況

Notch-1在正常口腔黏膜組織、OLP組織中均有表達。在正常口腔黏膜組，大多數(shù)細胞為陰性，在細胞密集的區(qū)域，可見少數(shù)的陽性細胞，其陽性著色主要見于細胞漿；在OLP組，其陽性物質(zhì)呈顆粒狀，密集分布于基底層細胞的細胞漿及細胞核，見圖2。統(tǒng)計學分析顯示，Notch-1在OLP組中的表達明顯高于正常口腔黏膜組（Z=-6.528，P=0.000），見表2。

2.3 Jagged-1的表達情況

Jagged-1在正?？谇火つそM織、OLP組織中均有表達。在正?？谇火つそM，其陽性著色少量散在分布于基底層細胞的細胞漿及細胞膜；在OLP組，陽性著色增強，其分布特點基本同正常黏膜組織，但較密集，見圖3。統(tǒng)計學分析顯示，Jagged-1在OLP組中的表達明顯高于正?？谇火つそM（Z=-6.630，P =0.000），見表3。

2.4 口腔黏膜組織中NF-κB、Notch-1、Jagged-1表達相關性分析

在口腔扁平苔蘚組中NF-κB與Notch-1的表達明顯相關（r=0.333，P=0.016），與Jagged-1的表達明顯相關（r=0.284，P=0.041），Notch-1與Jagged-1的表達具有顯著相關性（r=0.440，P=0.001），見表4～6。

圖1 NF-κB在口腔扁平苔蘚和正?？谇火つそM織中的表達（PV×100）

圖2 Notch-1在口腔扁平苔蘚和正常口腔黏膜組織中的表達（PV×100）

圖3 Jagged-1在口腔扁平苔蘚和正?？谇火つそM織中的表達（PV×100）

表1 NF-κB在口腔扁平苔蘚和正?？谇火つそM織中的表達

表2 Notch-1在口腔扁平苔蘚和正?？谇火つそM織中的表達

表3 Jagged-1在口腔扁平苔蘚和正常口腔黏膜組織中的表達

表4 口腔扁平苔蘚組織中NF-κB、Notch-1的相關性分析

表5 口腔扁平苔蘚組織中NF-κB、Jagged-1的相關性分析

表6 口腔扁平苔蘚組織中Notch-1、Jagged-1的相關性分析

3 討論

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的基因多向性轉錄因子，屬于Rel家族，因能與免疫球蛋白κ鏈基因的增強子κB序列（GGGACTTTCC）特異性結合而命名。NF-κB作為細胞內(nèi)最重要的一種核轉錄因子，能與多種基因啟動子或增強子的κB位點發(fā)生特異性結合，啟動和調(diào)節(jié)其基因轉錄，參與多種細胞活動，發(fā)揮其生物學功能，其中最主要的2個功能為調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白表達主要定位于細胞漿，偶見細胞核中，在基底層細胞和OLP組織固有層的T淋巴細胞中表達。其在OLP組織中的表達明顯高于正?？谇火つそM織。這一結果與SANTORO[5]等研究結果一致，均提示NF-κB與OLP的形成、發(fā)展及癌變密切相關。其作用機制有可能是通過對相關細胞因子（如IL-6、TNF-α及ICAM-1等）基因的誘導性調(diào)節(jié)作用，參與細胞的增殖、分化；或者是通過對凋亡蛋白和抗凋亡蛋白不平衡表達的調(diào)節(jié)作用；以及與腫瘤抑制蛋白（如p53）的直接作用實現(xiàn)抗凋亡功能。此外，不同的細胞、刺激因素以及同一細胞處于不同的病理生理狀態(tài)，都影響著NF-κB的活化及其調(diào)控基因的轉錄差異性，NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)是一條十分精細的調(diào)節(jié)途徑。

Notch信號通路是一條高度保守的細胞間轉導機制系統(tǒng)，廣泛參與各種組織細胞的分化、增殖及凋亡過程，具有重要作用。大量實驗已證實Notch信號通路具有致瘤和抑瘤雙重作用，對不同腫瘤乃至同一腫瘤的不同時期作用各不相同[6-7]。但關于Notch-1蛋白及其信號途徑在OLP的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮作用，發(fā)揮什么作用的問題，國內(nèi)外尚無報道。本研究通過免疫組化方法檢測Notch-1及其配體Jagged-1在OLP和正?？谇火つそM織中的表達，旨在初步明確其在OLP發(fā)生中可能的作用。實驗結果顯示：Notch-1蛋白表達主要定位于細胞漿，部分表達于細胞核，而Jagged-1蛋白的表達主要定位于細胞漿及細胞膜。Notch-1、Jagged-1在口腔扁平苔蘚組織中的表達顯著高于正?？谇火つそM織，這一結果提示Notch-1與Jagged-1在OLP的發(fā)生發(fā)展中可能起作用。

NF-κB與Notch-1之間存在一定的交互關系，有證據(jù)表明NF-κB家族是Notch信號轉導通路的目的基因之一，Notch-1可以通過重組信號結合蛋白JK（RBP-JK）在蛋白-蛋白水平及轉錄水平調(diào)節(jié)NF-κB表達下調(diào)，導致下游NF-κB的活性減低，最終導致細胞凋亡的發(fā)生[8]。本研究中對NF-κB、Notch-1及Jagged-1進行相關性分析，結果顯示：在OLP組中，NF-κB與Notch-1、Jagged-1的表達明顯相關，Notch-1與其配體Jagged-1的表達具有顯著相關性，提示在OLP中Notch-1和NF-κB兩條信號通路之間是有關聯(lián)的。

最近研究發(fā)現(xiàn)[9]通過Notch-1信號途徑的調(diào)節(jié)可以部分抑制NF-κB途徑的激活，其中IKKa激活能促進視黃酸和甲狀腺激素受體沉默中介蛋白（SMRT）在胞漿中的釋放，從而減少SMRT與Notch-1基因的靶點聯(lián)系，抑制腫瘤的生長。WANG等[10]采用RNA干擾技術使Notch-1和Jagged-1的表達下調(diào)，抑制前列腺癌細胞的生長，成功誘導癌細胞的凋亡，降低了癌細胞的侵襲浸潤能力，并且有效抑制NF-κB p65 DNA結合活性及其下游靶基因VEGF、MMP-9及uPA的表達。

綜上所述，Notch-1/NF-κB信號通路的異常激活在口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展過程中相互關聯(lián)，并有重要作用，這為以Notch-1/NF-κB信號通路為治療靶點研制開發(fā)相關藥物提供了理論依據(jù)，給OLP的臨床治療開辟了新的思路和方法。

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Expression and clinicopathological significance of NF-κB, Notch-1 and Jagged-1 in oral lichen planus*

Tie-jun LIU,Jian LIU,Yan-ning CHEN,Yan-zhi XU
(The Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang, Shijiazhuang,Hebei 050011,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 in human oral lichen planus and normal oral mucosa tissue,and analyze their correlations.And then we discussed the possible role of Notch-1/NF-κB signaling system in the development and progression of oral lichen planus.【Methods】Immunohistochemical staining was used to measure NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 in 52 cases oral lichen planus tissues and 30 cases normal mucosa tissues.And the differences of groups for immunohistochemical staining and the correlation of three proteins were analyzed by statistical methods.【Results】NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 expression level in oral lichen planus tissue was higher than that in normal mucosa tissue,which had statistical difference(P＜0.05). NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 had the significant correlation in oral lichen planus tissue(P＜0.05).【Conclusion】The unusual activation of Notch-1/NF-κB signaling system play a role in the occurrence and development of OLP．

oral lichen planus;NF-κB;Notch-1;Jagged-1

R781.54

A

1005-8982（2015）31-0026-04

2015-02-10

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學科學研究重點課題計劃（No：20120126）；河北省科技廳（No：12276104D－41）；河北省中醫(yī)藥管理局（No：2011013）；河北省衛(wèi)生廳（No：20100125）；國家自然基金課題（No：81273813）

許彥枝，E-mail：xu_yanzhi@163.com，Tel：15831183869