袁秀麗

（山東省臨沂市人民醫(yī)院東醫(yī)療區(qū)內(nèi)科三病區(qū)，山東 臨沂 276034）

·論著·

結(jié)核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值評估

袁秀麗

（山東省臨沂市人民醫(yī)院東醫(yī)療區(qū)內(nèi)科三病區(qū)，山東 臨沂 276034）

目的評估結(jié)核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值。方法選擇結(jié)核性腦膜炎患者58例作為觀察組，取同期原發(fā)性頭痛患者60例作為對照組，檢測兩組患者的血漿及腦脊液miRNAs含量，IL-6及IFN-γ水平，進(jìn)一步分析miRNAs含量與IL-6、IFN-γ水平的相關(guān)性。結(jié)果觀察組患者的血漿及腦脊液中miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144含量明顯高于對照組患者（P＜0.05）；血漿及腦脊液中IL-6、IFN-γ水平低于對照組患者（P＜0.05）；miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達(dá)量與血清IL-6、IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論結(jié)核性腦膜炎患者的miRNAs表達(dá)異常，一定程度上抑制機(jī)體免疫反應(yīng)、增強(qiáng)病原體毒性，其水平及終端炎癥因子水平的測定可以用于患者病情的判斷。

結(jié)核性腦膜炎；miRNAs；IL-6；IFN-γ

結(jié)核性腦膜炎起病隱匿，臨床表現(xiàn)不明顯，許多患者延誤最佳治療時機(jī)導(dǎo)致病情逐步加重，致殘率及致死率均較高。以往結(jié)核性腦膜炎的診斷主要依靠病原體檢測，但是存在檢測周期長、靈敏度低等缺陷，關(guān)于該病的快速有效的診斷手段探索一直是臨床研究的重點。微RNAs（microRNAs，miRNAs）近年來成為一種新型的疾病診斷標(biāo)志物，關(guān)于肺結(jié)核患者的體液中miRNAs表達(dá)的研究已經(jīng)開展較多，但是關(guān)于結(jié)核性腦膜炎患者的體液中miRNAs表達(dá)情況及其對疾病診斷的意義報道較少[1]。本次研究主要評估評估結(jié)核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值。具體匯報如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

研究對象取自2012年11月-2014年11月在本院治療的頭痛患者，其中，結(jié)核性腦膜炎患者58例作為觀察組，均經(jīng)結(jié)核DNA檢測陽性。其中，男性30例，女性28例；年齡33～67歲，平均（46.18± 8.93）歲，體重48～72 kg，平均（64.92±5.33）kg；原發(fā)性頭痛患者60例作為對照組，體格檢查未發(fā)現(xiàn)陽性體征，同時腦脊液檢測各項指標(biāo)值均在正常范圍內(nèi)。其中，男性32例，女性28例；年齡35～65歲，平均（47.82±7.81）歲，體重46～73 kg，平均（63.78± 5.29）kg。所有入組患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)通過，兩組患者的基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具有可相比。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集抽取所有研究對象的外周靜脈血2 ml，同時經(jīng)腰椎穿刺收集腦脊液3 ml，樣本在采集3 h內(nèi)進(jìn)行離心，取上清置于無酶凍存管內(nèi)，-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNAs含量的PCR檢測采用miRNA提取試劑盒抽提結(jié)核性腦膜炎患者血漿和腦脊液的總miRNA，使用加尾反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為對應(yīng)的cDNA；取cDNA標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144引物及反向通用引物均由天根公司提供，以U6為內(nèi)參照對miRNA-21的含量進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 ELISA檢測將樣本取出4℃冰箱內(nèi)融化，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定其中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）水平，具體操作步驟及注意事項按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間計量資料采用t檢驗，相關(guān)性分析采用一元線性回歸，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿miRNA水平

觀察組患者的血漿miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達(dá)量明顯高于對照組患者（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者的血漿miRNA水平比較

2.2 腦脊液miRNA水平

觀察組患者的腦脊液miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達(dá)量明顯高于對照組患者（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者的腦脊液miRNA水平比較

2.3 血漿及腦脊液炎癥因子水平

觀察組患者的血漿及腦脊液IL-6、IFN-γ水平均顯著高于對照組患者（P＜0.05），見表3。

2.4 miRNA表達(dá)與炎癥因子水平的相關(guān)性

經(jīng)一元回歸分析，觀察組患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達(dá)量與血清IL-6和IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表3 兩組患者的血漿及腦脊液炎癥因子水平比較（pg/ml±s）

表3 兩組患者的血漿及腦脊液炎癥因子水平比較（pg/ml±s）

組別IL-6IFN-γ血漿血漿腦脊液觀察組93.66±10.53 78.26±9.2727.95±2.1511.67±1.72對照組9.17±0.756.35±0.5310.72±0.853.72±0.51 t值10.2411.827.098.18 P值0.0100.0090.0190.015腦脊液

表4 miRNA表達(dá)與炎癥因子水平的相關(guān)性

3 討論

結(jié)核病是一個世界性的重大挑戰(zhàn)，據(jù)統(tǒng)計目前全球每年新增活動性結(jié)核病患者約800萬，并有約140萬人死于該病。結(jié)核分枝桿菌感染的具體分子機(jī)制目前尚未闡明，許多耐藥及泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)更是給世界衛(wèi)生安全帶來巨大威脅。microRNA（miRNA）是一類在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)起調(diào)控作用的單鏈非編碼RNA，長度為19～22個核苷酸，已經(jīng)有研究證實miRNA在細(xì)胞的死亡、增殖、癌變等環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要作用，miRNA表達(dá)失調(diào)與多種疾病發(fā)生包括病毒感染、肺部疾病、腫瘤等等密切相關(guān)[2]。關(guān)于miRNA與結(jié)核病之間的相關(guān)關(guān)系已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，miRNA芯片技術(shù)首次揭示了miRNA與肺結(jié)核的直接相關(guān)關(guān)系；HARAPAN[3]的研究表明活動性肺結(jié)核患者的痰液中存在miRNA的高表達(dá)，故有學(xué)者提出可以將miRNA作為結(jié)核病診斷的標(biāo)志物以及治療的靶點。

目前的研究揭示miRNA可以參與免疫細(xì)胞的成熟分化及活化，其通過選擇性的表達(dá)、干擾甚至抑制靶基因mRNA，最終發(fā)揮調(diào)控免疫反應(yīng)、免疫應(yīng)答等作用。柴璐璐[4]在對活動性肺結(jié)核及健康人群的血清miRNA-155表達(dá)量進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者的miRNA-155表達(dá)量增加約4倍，提示miRNA-155可能是活動性肺結(jié)核的潛在診斷標(biāo)志。miRNA-29a是新近發(fā)現(xiàn)的與多種疾病發(fā)生關(guān)系密切的小分子RNA家族，其靶基因主要是細(xì)胞外基質(zhì)及遷移蛋白，可以抑制多種膠原蛋白的表達(dá)，由于膠原蛋白的異常聚集是纖維化的基礎(chǔ)，故miRNA-29a在抗纖維化中發(fā)揮重要作用。同時miRNA是T細(xì)胞因子或者淋巴樣增強(qiáng)因子的負(fù)調(diào)控因子，可以通過靶向降解IFN-γ降低機(jī)體對病原體的免疫應(yīng)答，通過目標(biāo)基因IFN-γ來控制結(jié)核病的先天性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]。有研究顯示miRNA-144在結(jié)核病患者中表達(dá)量大增，其可以抑制TNF-α、IFN-γ產(chǎn)生以及T細(xì)胞增殖，進(jìn)一步抵抗結(jié)合感染過程中機(jī)體的免疫力。miRNA-155時結(jié)核桿菌介導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的必須物質(zhì)，有研究證實在敲除miRNA-155的大鼠中，結(jié)核分枝桿菌疫苗誘導(dǎo)的感染細(xì)胞凋亡受到抑制。miRNA-3179a也被認(rèn)為是結(jié)核性腦膜炎的標(biāo)志性miRNA，其水平高低與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[6]。上述研究結(jié)果顯示：觀察組患者的血漿及腦脊液中，miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a和miRNA-144表達(dá)量明顯高于對照組患者（P＜0.05），提示上述miRNA可以成為診斷結(jié)核性腦膜炎的特異性指標(biāo)。

在結(jié)核分枝桿菌感染患者中，諸多miRNA表達(dá)量的上調(diào)伴隨著TNF-α、IFN-γ及IL-6等炎癥因子水平的分泌量改變，在本次研究的結(jié)果顯示：觀察組患者的血漿及腦脊液IL-6、IFN-γ水平均顯著高于對照組患者（P＜0.05），提示結(jié)核分枝桿菌感染患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144高表達(dá)可以阻斷炎癥介質(zhì)表達(dá)，使結(jié)核分枝桿菌顛覆宿主免疫并增加其毒力，進(jìn)一步加重病情并增加治療難度[7]。在進(jìn)一步對miRNA與炎癥介質(zhì)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析后得出結(jié)果：觀察組患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達(dá)量與血清IL-6和IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），證實miRNA在結(jié)核分枝桿菌感染患者中通過參與介導(dǎo)免疫反應(yīng)并影響炎癥反應(yīng)來發(fā)揮對疾病轉(zhuǎn)歸的影響[8]。

綜上所述，筆者認(rèn)為，結(jié)核性腦膜炎患者的血漿及腦脊液中miRNAs表達(dá)異常，一定程度上抑制機(jī)體免疫反應(yīng)、增強(qiáng)病原體毒性，其水平及終端炎癥因子水平的測定可以用于患者病情的判斷及治療過程的指導(dǎo)。

[1]DORHOI A,IANNACCONE M,FARINACCIM,et al.MicroRNA-223 controls susceptibility to tuberculosis by regulating lung neutrophil recruitment[J].J Clin Invest,2013,123(11):4836-4848.

[2]劉守江,張帆,魏巍,等.外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染者中的表達(dá)[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013, 10(22):36-40.

[3]HARAPANH,FITRAF,ICHSANI,et al.The roles of microRNAs on tuberculosis infection:meaning or myth[J].Tuberculosis(Edinb), 2013,93(6):596-605.

[4]柴璐璐,田宋新,袁俐,等.miR-125b、miR-29a和miR-155-5p作為診斷結(jié)核性腦膜炎生物標(biāo)志的研究[J].天津醫(yī)藥,2015,43(6): 674-678.

[5]ABD-EL-FATTAH AA,SADIKNA,SHAKEROG,et al.Differential microRNAs expression in serum of patients with lung cancer, pulmonary tuberculosis,and pneumonia[J].Cell Biochem Biophys, 2013,67(3):875-884.

[6]高采平,周超,熊飛,等.腹水[w3]miR-4455和miR-29a在結(jié)核和腫瘤中的表達(dá)差異研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,37(4):370-374.

[7]曹帥麗,袁俐.結(jié)核病相關(guān)miRNA研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報,2014,30(7):757-760.

[8]SINGH Y,KAULV,MEHRAA,et al.Mycobacterium tuberculosis controls microRNA-99b(miR-99b)expression in infected murine dendritic cells to modulate host immunity[J].J Biol Chem,2013, 288(7):5056-5061.

Detection of mirnascontentin plasma and cerebrospinal fluidin patients with tuberculous meningitis and its clinical value evaluation

Xiu-li YUAN
(Department of Inner Medicine,East Medical District of Linyi People's Hospital, Linyi,Shandong 276034,P.R.China)

【Objective】To evaluate miRNAs content in plasma and cerebrospinal fluid in patients with tuberculous meningitis and its clinical value.【Method】58 cases of patients with tuberculous meningitis were enrolled as observation group,60 cases patients with primary headache at same period were enrolled as control group.Then miRNAs,IL-6 and IFN-γcontents in plasma and cerebrospinal fluid were detected and the correlation of miRNAs content with IL-6,IFN-γ contents was further analyzed.【Results】miRNA-125b,miRNA-29a, miRNA-155,miRNA-3179a,miRNA-144 contents in plasma and cerebrospinal fluid of observation group were significantly higher than control group(P＜0.05);IL-6,IFN-γ levels in plasma and cerebrospinal fluid were higher than control group(P＜0.05);miRNA-125b,miRNA-29a,miRNA-155,miRNA-3179a,miRNA-144 contents were negatively correlated with serum IL-6,IFN-γ levels(P＜0.05).【Conclusion】miRNAs expression in tuberculous meningitis patients are abnormal and can inhibit immune response,enhance pathogen toxicity at some extent; determination of their level and terminal inflammatory factors levels of can be used for the judgment of disease.

tuberculous meningitis;miRNAs;IL-6;IFN-γ

R529.3

A

1005-8982（2015）31-0022-04

2015-03-21