夏云展，解寒冰，孫德利，李瓊

（河南省鄭州人民醫(yī)院1.普通外科，2.神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

·論著·

microRNA181b在老年肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及其對癌細(xì)胞遷移的影響

夏云展1，解寒冰1，孫德利1，李瓊2

（河南省鄭州人民醫(yī)院1.普通外科，2.神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

目的探討microRNA-181b在老年肝細(xì)胞癌（HCC）組織以及患者血漿中的表達(dá)水平以及對肝癌細(xì)胞遷移的影響。方法選取該院40例HCC患者為研究組，40例同期來該院體檢的人群為對照組，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測老年肝細(xì)胞癌組織及對應(yīng)癌旁組織中以及患者和正常人群血漿中microRNA-181b表達(dá)水平；對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721干擾microRNA-181b后，采用transwell法觀察其侵襲水平；并采用RT-PCR以及Western blot檢測了SMMC-7721細(xì)胞中CXCR4的mRNA及蛋白水平。結(jié)果microRNA-181b在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；microRNA-181b在肝癌患者血漿中的表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，microRNA-181b在肝細(xì)胞癌組織及血漿中表達(dá)與肝癌的分化程度均呈顯著正相關(guān)（r=0.572，P＜0.05；r= 0.616，P＜0.05）；而肝癌癌旁組織中microRNA-181b表達(dá)與肝癌分化程度無顯著相關(guān)（r=0.216，P＞0.05）。干擾microRNA-181b的SMMC-7721細(xì)胞遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且干擾microRNA-181b的SMMC-7721細(xì)胞CXCR4的mRNA及蛋白水平降低。結(jié)論microRNA-181b在老年肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并且與肝癌細(xì)胞的分化程度關(guān)系密切，microRNA-181b可能通過影響CXCR4來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。

microRNA-181b；原發(fā)性肝細(xì)胞癌；遷移；CXCR4

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡稱肝癌，是惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位、死因的第3位，全世界每年大約有100萬人死于肝癌，其中老年人是高發(fā)人群[1]。然而目前為止，肝癌的發(fā)病機制尚未完全明確，人們普遍認(rèn)為癌基因的激活或者是抑癌基因的異常失活是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的主要原因。MicroRNA（miRNA）是一類新近發(fā)現(xiàn)的長度約為22個核昔酸的非編碼單鏈小分子RNA。隨著對miRNA的深入研究發(fā)現(xiàn)，其異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著極其密切的聯(lián)系[2-4]。microRNA-181b是較早發(fā)現(xiàn)的的人類miRNA之一，有研究認(rèn)為microRNA-181b卵巢癌患者中高表達(dá)，且能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和侵襲[5]，而microRNA-181b在非小細(xì)胞肺癌患者中低表達(dá)[6]。然而，目前為止，microRNA-181b在肝癌患者的表達(dá)高低極其對肝癌細(xì)胞潛在的功能的研究尚少報道。本研究對比了microRNA-181b在老年肝細(xì)胞癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，分析其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的聯(lián)系，并探討其對肝細(xì)胞癌侵襲極其機制的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

所有組織來源于2012年8月-2014年2月期間來本院就醫(yī)的老年患者的手術(shù)切除標(biāo)本。其中，研究組中共40例。其中，男18例，女22例；年齡61～75歲，平均（64.12±8.18）歲。術(shù)前均未經(jīng)任何介入或化療等任何處理，所有患者均接受了肝癌根治性切除手術(shù)處理，所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實為肝細(xì)胞癌，分別取肝癌及對應(yīng)癌旁組織待用。對照組為同期健康體檢人群40例。其中，男19例，女21例；年齡60～73歲，平均（65.21±7.98）歲。肝癌的組織于術(shù)中離體30 min內(nèi)取材，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片備用。HCC組織根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)分級：Ⅰ級6例；Ⅱ級11例；Ⅲ級13例；Ⅳ級10例。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Femantes公司，DNA Marker、 PCR試劑盒、焦碳酸二乙脂（DEPC）均購于生興生化科技（南京）有限公司，microRNA-181b的抑制物及U6內(nèi)參的引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.3 組織以及血漿標(biāo)本總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

肝細(xì)胞癌患者手術(shù)中取肝癌及對應(yīng)癌旁組織。此外，清晨空腹時抽取肝癌患者及正常人群的外周靜脈血5 ml，加入EDTA抗凝劑，2 h內(nèi)于4℃下高速離心4 000 g，5 min。離心后提取上層血漿放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取約150 mg組織或200 ml血漿，加入1 ml Trizol，充分勻漿，抽提總RNA，所得RNA溶于25 ml的DEPC水中。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計進(jìn)行定量及檢測純度。進(jìn)一步用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s進(jìn)行40個循環(huán)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體2000（美國Invitrogen公司）對人的肝癌細(xì)胞SMMC-7721中microRNA-181b低表達(dá)，于48 h候檢測其干擾效率。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及遷移實驗

改良型RPMI1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO公司，人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721購自于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。SMMC-7721培養(yǎng)于含100 ml/L的胎牛血清的改良型RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，50 ml/L的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代3代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗，調(diào)整肝癌細(xì)胞密度至3×l05個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h時間后，對己遷移至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)（隨機選取5個視野）。

1.6 免疫印跡檢測蛋白水平

收集SMMC-7721細(xì)胞，加入1×SDS細(xì)胞裂解液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，100 V電壓轉(zhuǎn)膜10 min，37℃封閉90 min，加兔抗人的CXCR4（Biolegend）4℃孵育過夜后，HRP標(biāo)記的小鼠抗兔二抗（南京生興生物）（1∶1 000稀釋）37℃孵育30 min，ECL發(fā)光檢測。內(nèi)參蛋白選用sigma公司的抗人-actin（1∶3 000稀釋）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計作圖用GraphPad Prism 4.0軟件，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間差異比較采用Student’st檢驗，兩變量參數(shù)相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織及對應(yīng)癌旁組織中microRNA-181b mRNA的表達(dá)水平

與癌旁組織比較，microRNA-181b在肝癌組織中mRNA的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.77，P＜0.05），以上結(jié)果提示高表達(dá)的microRNA-181b在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。見表1。

表1 肝癌及對應(yīng)癌旁組織中microRNA-181bmRNA的表達(dá)水平

2.2 肝細(xì)胞癌患者血漿中microRNA-181b mRNA的表達(dá)水平

microRNA-181b在肝細(xì)胞癌患者血漿中mRNA表達(dá)水平顯著高于正常人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 15.63，P＜0.05），進(jìn)一步提示了肝細(xì)胞癌患者血漿中高表達(dá)microRNA-181b與肝癌的進(jìn)展有著密切的聯(lián)系。

2.3 肝細(xì)胞癌組織及血漿中microRNA-181b表達(dá)水平與肝癌組織病理分級的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示肝癌組織中microRNA-181b mRNA表達(dá)水平與肝癌的分化程度顯著正相關(guān)（r= 0.591，P＜0.05）（表3），且血漿中microRNA-181b mRNA表達(dá)水平與肝癌組織的分化程度顯著正相關(guān)（r=0.637，P＜0.05）（表3），提示了肝細(xì)胞癌的分化愈差，microRNA-181b表達(dá)愈強。而肝癌患者癌旁組織中microRNA-181b mRNA表達(dá)與肝癌的分化程度未見顯著相關(guān)（r=0.253，P＞0.05）（表3）。

表2 肝癌患者及正常人群血漿中microRNA-181bmRNA的表達(dá)

表3 microRNA-181b mRNA表達(dá)強度與肝細(xì)胞癌分化程度的關(guān)系

圖1 低表達(dá)microRNA-181b對肝癌細(xì)胞侵襲的影響

2.4 低表達(dá)microRNA-181b對肝癌細(xì)胞侵襲功能的影響

SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA-181b抑制物后，microRNA-181b水平顯著降低（圖1A），說明低表達(dá)效果成功。與對照組比較，SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA-181b抑制物后，transwell小室下層細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖1B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示了microRNA-181b具有促進(jìn)肝癌的癌細(xì)胞侵襲能力。

2.5 干擾microRNA-181b對肝癌細(xì)胞CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)影響

為了探討microRNA-181b對于SMMC-7721細(xì)胞侵襲影響的機制，我們檢測干擾microRNA-181b基因后肝癌細(xì)胞的CXCR4的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，干擾microRNA-181b的肝癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4的mRNA（2A）和蛋白（2B）水平均顯著降低，提示了microRNA-181b可能是通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞CXCR4的表達(dá)來影響癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 低表達(dá)microRNA-181b對肝癌細(xì)胞遷徙基因CXCR4水平影響

3 討論

肝癌是世界上比較常見的一種惡性腫瘤，它的診斷和治療一直都是臨床上的難題之一。目前認(rèn)為，原發(fā)性肝癌的發(fā)生及發(fā)展是一個涉及到多基因、多通路、多步驟的復(fù)雜過程[7]。因此，尋找到肝癌特異性的診斷靶點成為人們感興趣的科學(xué)問題。目前，一般認(rèn)為導(dǎo)致肝癌發(fā)生的主要原因為抑癌基因的異常失活或者致癌基因的激活[8]。近年來，表觀遺傳學(xué)及其對于惡性腫瘤的調(diào)控機制越來越多的被人們進(jìn)行深入的研究，這對尋找到腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵表觀遺傳分子，為癌癥的早期診斷和治療提供重要的參考依據(jù)。

microRNA作為一種在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的約22個核苷酸大小的小分子RNA，廣泛的存在于組織、血漿或血清以及其他體液中，且在體內(nèi)表達(dá)比較穩(wěn)定。近年來，腫瘤的表觀遺傳學(xué)調(diào)控和microRNA分子的調(diào)控越來越受到關(guān)注。microRNA在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中具有及其重要的作用：既具有抑癌基因又具有癌基因的特性，其可對一系列重要的抑癌或者促癌基因的起著重要的調(diào)控作用[9-13]。

本研究檢測microRNA-181b在老年肝癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中microRNA-181b的表達(dá)水平均高于對應(yīng)的癌旁組織，且與肝癌Edmonson分級顯著正相關(guān)；此外，肝癌患者血漿中microRNA-181b表達(dá)高于正常人群，且與肝癌的臨床分期顯著正相關(guān)，這些結(jié)果均說明了microRNA-181b在肝癌患者癌組織以及血漿中的表達(dá)水平可能與肝癌發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。MENG等[14]學(xué)者在分析胰腺癌組織時發(fā)現(xiàn)microRNA-181b較正常對照組顯著上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)microRNA-181b能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，這與本研究基本一致。

趨化因子受體4（CXCR4）是CXC趨化因子亞家族中一類重要的受體，其在腫瘤中發(fā)揮多種作用，特別是與腫瘤細(xì)胞的遷移等密切相關(guān)[15]。為了探索microRNA-181b影響肝癌細(xì)胞的遷移機制，筆者檢測了低表達(dá)microRNA-181b的肝細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾microRNA-181b的肝癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4的mRNA和蛋白水平均降低，從而提示microRNA-181b通過增加肝癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。分析其機制可能是CXCR4通過增加可使細(xì)胞肌動蛋白絲聚合，形成偽足，引起定向遷移、侵襲，利于腫瘤生長。這與Nikzaban, Mehrnoush等認(rèn)為在胃癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)水平與胃癌侵襲和浸潤密切相關(guān)的結(jié)果一致[16]。

綜上所述，microRNA-181b在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，老年肝癌患者癌組織以及血漿中microRNA-181b的檢測對于對患者臨床個體化治療以及預(yù)后可能具有一定的指導(dǎo)意義。

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Expression of microRNA181b in primary hepatocellular carcinoma in the elderly and the effects of cancer cell migration

Yun-zhan XIA1,Han-bing XIE1,De-li SUN1,Qiong LI2
(1.Department of General Surgery;2.Department of Neurology,Zhengzhou People's Hospital, Zhengzhou,Henan 450003,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of microRNA-181b in primary HCC tissue and plasma of patients as well as migration of hepatoma cells.【Methods】40 cases of primary HCC patients in our hospital as the study group,40 healthy volunteers were used as control group,we used RT-PCR to detect the expression of microRNA-181b in liver cancer and adjacent cancer tissues.After SMMC-7721 interference microRNA-181b,invasion levels were observed using transwell law;and detect the mRNA and protein levels of CXCR4 by RT-PCR and Western blot.【Results】the expression of microRNA-181b in primary HCC tissues was significantly higher than the corresponding adjacent tissues,the difference was statistically significant(P＜0.05);expression of microRNA-181b in primary liver cancer patients was significantly higher in the plasma,the difference was statistically significant(P＜0.05).The expression of microRNA-181b in primary HCC tissue and plasma and liver cancer were significantly positively correlated by Spearman correlation analysis(r=0.572,P＜0.05;r=0.616,P＜0.05).The mRNA and pro－tein levels of CXCR4 were reduced after interference of microRNA-181b in SMMC-7721 cells.【Conclusion】the expressions of microRNA-181b in elderly primary HCC are increased and closely related to the degree of differentiation,microRNA-181b may be to facilitate the migration of liver cancer cells by affecting CXCR4.

microRNA-181b;primary hepatocellular carcinoma;migration;CXCR4

1005-8982（2015）31-0017-05

R735.7

A

2015-06-17