周煥城，彭廣福，宋越，張彩云，王捷

（1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510000；2.廣東省梅州市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 梅州 514000）

·論著·

肝細(xì)胞癌患者血清中CD31表達(dá)水平及其對腫瘤細(xì)胞侵襲及增殖的影響

周煥城1，彭廣福2，宋越2，張彩云2，王捷1

（1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510000；2.廣東省梅州市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 梅州 514000）

目的探討肝細(xì)胞癌（HCC）患者血清CD31表達(dá)水平以及對肝癌細(xì)胞侵襲和增殖影響。方法選取該院45例HCC患者為研究組，45例同期體檢的健康人群為對照組，ELISA檢測肝癌患者血清CD31表達(dá)水平；采用小分子干擾RNA（siRNA）抑制肝癌細(xì)胞中CD31的表達(dá)，transwell法觀察CD31對肝癌細(xì)胞侵襲的影響，CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測肝癌細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果CD31在肝癌患者血清中的表達(dá)水平顯著高于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；抑制肝癌細(xì)胞中CD31的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CD31在肝癌患者血清中高表達(dá)，并可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。

CD31；肝細(xì)胞癌；侵襲；增殖

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡稱肝癌，是惡性程度最高、最常見的腫瘤之一，具有進(jìn)展快、治療復(fù)雜及生存時間短等特點(diǎn)，目前仍以手術(shù)切除為主要治療手段，國外學(xué)者研究報道肝癌5年生存率12%左右，而國內(nèi)學(xué)者研究認(rèn)為肝癌5年生存率約為32.5%[1-2]。目前為止，肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，越來越多的研究者關(guān)注肝癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)對肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸的影響。

CD31又稱為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31），最早發(fā)現(xiàn)于1990年[3]，分子量約為130 kDa，其結(jié)構(gòu)屬于免疫球蛋白超家族成員，近年來的研究表明CD31與動脈粥樣硬化癥、肺癌及卵巢癌[4-6]等多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，然而，CD31在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中作用的報道尚少。本文旨在研究CD31在肝細(xì)胞癌患者血清中的表達(dá)，以及干擾肝癌細(xì)胞中CD31表達(dá)后，對肝癌細(xì)胞侵襲及增殖能力的影響，從而對于肝細(xì)胞癌的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年6月-2015年3月，本科室肝癌手術(shù)患者45例為研究組。男21例，女24例；年齡39～75歲，平均（51.67±7.37）歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)介入或放化療等治療，均接受了肝癌根治性切除術(shù)，所有患者術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為肝細(xì)胞癌，且未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，排除合并其他慢性病如高血壓、糖尿病，或其他腫瘤的患者。對照組為同期健康體檢人群45例。其中，男20例，女25例；年齡37～78歲，平均（54.02±7.98）歲。

1.2 主要試劑

SMMC-7721細(xì)胞購自ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，熒光標(biāo)記的2'-O-甲基siRNA CD31-FAM、穩(wěn)定陰性對照siRNA CD31-NC和CD31引物購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司，Real-time PCR試劑盒購自Roche公司，抗CD31抗體購自Abcam公司，抗β-actin抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司，CCK-8購自上海博谷生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，以1×105個/平皿,接種于6 cm平皿，或以4×106個細(xì)胞/平皿,接種于10 cm平皿，孵育細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體2000（美國Invitrogen公司）對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中CD31 mRNA抑制表達(dá)，于48 h候檢測其干擾效率。CD31 siRNA干擾序列：正向5'-UUCCGUUCUAGAGUAUCUG-3'，反向5'-CAGA UACUCUAGAACGGAA-3'。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 ELISA檢測肝癌患者血清CD31表達(dá)水平取研究組和對照組患者外周血2 ml，靜置6 h后，離心取上清，依照產(chǎn)品說明書，ELISA試劑檢測兩組CD31的表達(dá)水平。

1.5.2 Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中CD31mRNA表達(dá)水平將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，用Trizol提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以作為GAPDH內(nèi)參，依照產(chǎn)品說明書，測定TNF-α的變化。CD31引物序列正向：TCCAGGCCAGCTGCTCCACTT；反向：GCCTTCCGTTCTCTTGGTGAGGC。

1.5.3 Western blot檢測肝癌細(xì)胞中CD31蛋白表達(dá)水平肝癌細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照蛋白抽提步驟，提取總蛋白；采用BCA法測定總蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗滌后，分別加入1∶1 000抗CD31抗體、1∶500抗β-actin抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，再用TBST洗滌，化學(xué)發(fā)光并曝光成像。Weastern blot檢測以β-actin條帶作為內(nèi)參，CD31條帶與其比較，觀察CD31蛋白表達(dá)變化。

1.5.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×l05個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，對己遷移至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)（隨機(jī)選取5個視野）。

1.5.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期的細(xì)胞以50%的匯合率接種至96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)基作為對照，37℃，5%二氧化碳CO2，95%濕度下培養(yǎng)24 h后，分別在培養(yǎng)孔加入10μl CCK-8溶液；再置于孵箱孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光值，每孔實(shí)測OD值需減去空白對照OD值，取3復(fù)孔平均值，記錄OD值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者血清CD31表達(dá)水平

與建康人群相比，CD31在肝癌患者血清中的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），提示CD31的高表達(dá)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能（表1）。

附表 肝癌患者血清中CD31的表達(dá)水平

2.2 肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNACD31后CD31表達(dá)變化

SMMC-7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA CD31后，同對照相比，CD31mRNA的表達(dá)水平明顯下降（見圖1A），CD31蛋白表達(dá)水平也明顯降低（見圖1B），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示低表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA CD31后肝癌細(xì)胞中CD31表達(dá)變化

2.3 肝癌細(xì)胞中CD31對細(xì)胞侵襲功能的影響

SMMC-7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNACD31后，同對照相比，transwell小室下層細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），提示了CD31具有增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲能力。

圖2 肝癌細(xì)胞中CD31對細(xì)胞侵襲功能的影響

2.4 肝癌細(xì)胞中CD31對細(xì)胞增殖的影響

SMMC-7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA CD31后，同對照相比，肝癌細(xì)胞增殖顯著減少（圖3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），提示了CD31具有增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲能力。

圖3 肝癌細(xì)胞中CD31對細(xì)胞增殖的影響

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第5位，病死率居第3位，而且55%的肝癌患者分布于我國[7]。目前，肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，診斷和治療仍是臨床難題之一。近年來，研究學(xué)者認(rèn)為基因調(diào)控在肝癌發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，特別是對肝癌細(xì)胞的黏附、侵襲和增殖的影響[8]，所以，肝癌細(xì)胞特異性的基因調(diào)控靶點(diǎn)是肝癌的診斷和治療的全新研究方向。

CD31/PECAM-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，可以通過細(xì)胞間、細(xì)胞核細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)。隨著研究的深入，在腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD31，在腫瘤的基因調(diào)控中發(fā)揮作用[9-10]。本研究檢測肝癌患者血清CD31的表達(dá)水平明顯高于正常健康人群，提示高表達(dá)CD31可能起到調(diào)控肝癌細(xì)胞中的信號途徑[11]，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。這與DAROM等人[12]研究發(fā)現(xiàn)CD31/ PECAM-1在非何杰金氏胃淋巴瘤患者體內(nèi)表達(dá)增高結(jié)果是一致的，從側(cè)面支持了本研究。

小分子干擾RNA（small interference RNA，siRNA）正逐漸取代反義核苷酸技術(shù)，成為腫瘤基因療法的理想工具[13]。研究表明，陽離子脂質(zhì)體可有效地實(shí)現(xiàn)siRNA的靶向輸送，2'-O-甲基修飾的siRNA可提高siRNA的穩(wěn)定性[14]。本研究通過siRNA干擾抑制肝癌細(xì)胞中CD31的表達(dá)，用以研究CD31對肝癌細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示采用siRNA干擾抑制CD31的表達(dá)后，檢測肝癌細(xì)胞中CD31的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著低于未受干擾的肝癌細(xì)胞，，說明低表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力與腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長速度密切相關(guān)，影響著腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[15-16]。本研究運(yùn)用已構(gòu)建成功的低表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞與未受干擾抑制高表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞相比，通過transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞的侵襲能力顯著強(qiáng)于低表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞，說明CD31表達(dá)水平的高低影響著肝癌細(xì)胞的侵襲能力。此外，本研究運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)研究肝癌細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD31肝癌細(xì)胞的增殖能力顯著強(qiáng)于低表達(dá)CD31的肝癌細(xì)胞，說明CD31表達(dá)水平越高，肝癌細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。CD31的表達(dá)水平影響肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，這與TACHEZY M等人在導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤中的研究結(jié)果是一致的[17]。

綜上所述，在肝癌患者血清中CD31的表達(dá)水平顯著升高，而且抑制CD31的表達(dá)水平可能減弱肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，從而使肝癌生長速度減慢，侵襲能力下降，這為肝癌的診斷和治療的新靶點(diǎn)提供了理論參考依據(jù)。

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Expression of CD31 in the serum of hepatocellular carcinoma patients and the effects of cancer cell migration and proliferation

Huan-cheng ZHOU1,Guang-fu PENG2,Yue SONG2,Cai-yun ZHANG2,Jie WANG1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Sun Yet-sen Memorial Hospital of Zhongshan University, Guangzhou,Guangdong 510000,P.R.China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Meizhou People's Hospital,Meizhou,Guangdong 514000,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of CD31 in the serum of HCC patients and the effects of cancer cell migration and proliferation.【Methods】45 cases of HCC patients in our hospital as the study group,40 healthy volunteers were used as control group,we used ELISA to detect the expression of CD31 in the serum of HCC patients.Using small interfering RNA(siRNA)to inhibit the expression of CD31 in hepatocellular carcinoma,the level of cancer cell migration was observed by transwell and the level of cell proliferation was observed by CCK-8.【Results】the expression of CD31 in the serum of HCC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05);After the expression of CD31 was suppressed in hepatocellular carcinoma,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant(P＜0.05).【Conclusion】the expression of CD31 in the Serum of HCC patients is increased, and may elevate the levels of cancer cell migration and proliferation.

CD31;hepatocellular carcinoma;migration;proliferation

R735.7

A

1005-8982（2015）31-0005-05

2015-04-23

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項(xiàng)目（No：S2012040007235）

王捷，E-mail：fxd531sgr@126.com