孫麗芳，楊波，石少波，劉韜，阮兵，梁錦軍

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

慢性應(yīng)激對(duì)心臟交感神經(jīng)和室性心律失常易感性的影響*

孫麗芳，楊波，石少波，劉韜，阮兵，梁錦軍

目的：探討慢性應(yīng)激對(duì)心臟交感神經(jīng)和室性心律失常易感性的影響。

方法：將30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和慢性應(yīng)激組，每組15只。對(duì)照組正常條件下飼養(yǎng)，慢性應(yīng)激組給予慢性不可控應(yīng)激刺激4周，用曠場(chǎng)試驗(yàn)和糖水試驗(yàn)評(píng)估行為學(xué)，用短陣快速刺激（Burst刺激）評(píng)估麻醉狀態(tài)下室性心律失常誘發(fā)率，采用免疫組化法檢測(cè)心臟交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)酪氨酸羥化酶的變化。

結(jié)果：造模后，慢性應(yīng)激組較對(duì)照組糖水偏愛比及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。麻醉狀態(tài)下，慢性應(yīng)激組血壓與對(duì)照組比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），心率較對(duì)照組快（P＜0.05），室性心律失常誘發(fā)率較對(duì)照組高 （P＜0.05）。心肌Masson染色顯示：慢性應(yīng)激組心室肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（3.94±1.81）%高于對(duì)照組（2.71±1.64）%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化結(jié)果：慢性應(yīng)激組心室肌酪氨酸羥化酶含量（1397.8±268.8）μm2/mm2較對(duì)照組（995.0±232.3 ）μm2/mm2增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：慢性應(yīng)激能增加室性心律失常的易感性，心臟交感神經(jīng)重構(gòu)可能是其重要機(jī)制。

慢性應(yīng)激；室性心律失常；交感重塑

Methods: A total of 30 SD rats were randomly assigned into two groups: Control group, the rats were fed with normal condition and Chronic stress group, the rats were fed with unpredictable chronic stimulus program. n=15 in each group and all animals were treated for 4 weeks. The behavior of rats was assessed by open field test and sucrose intake test, the susceptibility of ventricular arrhythmia was measured by Burst stimulus program under narcosis condition, and the sign of cardiac sympathetic nerve reconstruction, tyrosine hydroxylase content was examined by immunohistochemistry.

Results: Compared with Control group, Chronic stress group had decreased ratio of sucrose favorite/open field test, P＜0.05 and increased susceptibility of ventricular arrhythmia, P＜0.05. Masson staining showed that the ventricular collagen score was similar between 2 groups, P＞0.05. Immunohistochemistry presented that Chronic stress group had much higher tyrosine hydroxylase content (1397.8 ± 268.8) um2/mm2than Control group (995 ± 232.3) um2/mm2, P＜0.05.

Conclusion: Chronic stress may increase the susceptibility of ventricular arrhythmia in experimental rats, and the cardiac sympathetic nerve reconstruction might be an important mechanism.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:270.)

應(yīng)激與心血管系統(tǒng)功能關(guān)系密切，嚴(yán)重的精神刺激損害心臟會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激性心肌病，而慢性應(yīng)激或情緒障礙是心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。心血管疾病患者常常伴有抑郁、焦慮或者憤怒等情緒，處于身體和心理應(yīng)激狀態(tài)，慢性應(yīng)激不僅嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，而且顯著增加遠(yuǎn)期心血管事件發(fā)生率[2,3]。研究表明抑郁使心血管疾病患者發(fā)生急性心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加50%，盡管在校正了共存疾病及左心室射血分?jǐn)?shù)后，風(fēng)險(xiǎn)仍然有顯著增加[1]。HUNT2研究顯示伴有抑郁或焦慮性情緒應(yīng)激的心肌梗死患者，其心肌梗死再發(fā)率顯著增高[4]。上述研究提示慢性情緒應(yīng)激可導(dǎo)致心血管疾病,增加心血管事件發(fā)生率。然而其具體病理機(jī)制尚未明確，可能與心臟神經(jīng)重塑所致室性心律失常風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。為此，本研究通過4周慢性不可預(yù)見性慢性應(yīng)激程序刺激動(dòng)物，建立以抑郁為主要表現(xiàn)的慢性應(yīng)激模型，探討慢性應(yīng)激刺激對(duì)心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的影響，試圖驗(yàn)證上述假設(shè)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：本研究時(shí)間為2014-02至2014-07。將30只SD大鼠（180～220 g，購于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室）隨機(jī)分為對(duì)照組（n=15）和慢性應(yīng)激組（n=15）。實(shí)驗(yàn)開始前在清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周。

慢性應(yīng)激刺激：慢性應(yīng)激模型制作參考Gronli等[5]的方法。慢性應(yīng)激組15只大鼠禁水24 h，潮濕墊料24 h，行為限制2 h，夜間頻閃燈8 h，禁食24 h，鼠籠傾斜45度24 h，冰水浴5 min。將上述7種刺激方法隨機(jī)安排到28 d內(nèi)，每日1種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，以使動(dòng)物不可預(yù)料刺激的發(fā)生。刺激方案如下（表1）：

表1 慢性應(yīng)激組15只大鼠刺激方案

行為學(xué)評(píng)價(jià)：采用糖水實(shí)驗(yàn)[6]和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[7]進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。糖水實(shí)驗(yàn)：大鼠單籠飼養(yǎng)并編號(hào)，實(shí)驗(yàn)開始前給大鼠進(jìn)行糖水適應(yīng)性訓(xùn)練，前12 h均給1瓶1%蔗糖水和1瓶純水，后12 h交換兩瓶水的位置，以防大鼠對(duì)飲水形成位置偏好。然后禁水禁食24 h，再給每只大鼠已稱重的1%蔗糖水和純水各1瓶，記錄1h后每只大鼠每瓶水的消耗量。計(jì)算糖水偏愛百分比[糖水偏愛百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：曠場(chǎng)大小為120 cm×90 cm×35 cm，試驗(yàn)在早9:00進(jìn)行。將大鼠置于曠場(chǎng)中心內(nèi)，使用動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)（Ethovision3.0）記錄并分析大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)10 min的行為：大鼠10 min內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離，直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附曠場(chǎng)壁）。單只獨(dú)立測(cè)試，每次測(cè)試完成后，均要將糞便清理干凈。

心電圖和血壓監(jiān)測(cè)：動(dòng)物在麻醉[鹽酸戊巴比妥鈉，40 mg/（ml·kg）,腹腔注射，美國sigma公司]10 min 后, 游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端插入動(dòng)脈導(dǎo)管，記錄平均動(dòng)脈壓。同時(shí)記錄體表Ⅱ?qū)?lián)心電圖（PowerLab放大器,澳大利亞AD公司）10 min,運(yùn)用Chart 7.0軟件分析血壓和心率。

室性心律失常誘發(fā)：在麻醉狀態(tài)下，進(jìn)行氣管插管，開胸暴露心臟，行短陣快速脈沖刺激（Burst刺激），誘發(fā)室性心律失常。Burst刺激程序：將刺激電極置于右心室流出道，行每陣2 s的超速刺激，刺激周長(zhǎng)為20 ms,電壓為2倍的閾電位。室性心律失常定義為大于2 s的心室快速激動(dòng)，若未誘發(fā)，Burst刺激重復(fù)三次。根據(jù)室性心律失常的誘發(fā)率評(píng)價(jià)室性心律失常的易感性。本部分實(shí)驗(yàn)在10 min內(nèi)完成。

Masson染色及免疫組化：在電生理實(shí)驗(yàn)完成后，迅速取出心臟，將心肌組織固定，脫水，石蠟包埋，每個(gè)心肌組織制備5張連續(xù)切片,依次滴加Masson復(fù)合染色液，磷鉬酸，苯胺藍(lán)，最后滴加分化液進(jìn)行分化。免疫組化一抗為抗小鼠TH抗體（1：200，美國sigma公司），二抗為通用SP抗體（美國sigma公司），參照試劑盒提供的步驟進(jìn)行染色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定心室肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（膠原面積／全視野組織面

積），比較兩組膠原的分布排列及纖維化的面積。使用Image-Pro plus6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行量化分析，計(jì)算陽性纖維或結(jié)構(gòu)在選區(qū)中表達(dá)量。采用免疫組化法檢測(cè)心臟交感神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)酪氨酸羥化酶的變化。

2 結(jié)果

2.1 兩組行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

在造模前，評(píng)估兩組大鼠糖水偏愛比及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。造模后，顯示慢性應(yīng)激組較對(duì)照組糖水偏愛比及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。表2

2.2 兩組造模后血壓、心率、室性心律失常誘發(fā)率比較

麻醉狀態(tài)下，慢性應(yīng)激組與對(duì)照組比血壓差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；心率較對(duì)照組快（P＜0.05），室性心律失常誘發(fā)率較對(duì)照組高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3

表2 兩組行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表2 兩組行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與對(duì)照組造模后比較*P＜0.05

?

表3 兩組造模后血壓、心率、室性心律失常誘發(fā)率比較

表3 兩組造模后血壓、心率、室性心律失常誘發(fā)率比較

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

?

2.3 兩組Masson染色及免疫組化結(jié)果

心肌Masson染色顯示：對(duì)照組心室肌間質(zhì)空隙較小，少量膠原沉積；慢性應(yīng)激組心室肌間質(zhì)空隙大，心肌纖維排列紊亂，膠原沉積明顯（圖1）；慢性應(yīng)激組心室肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（3.94±1.81）%高于對(duì)照組（2.71±1.64）%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化結(jié)果：TH抗體表達(dá)量慢性應(yīng)激組較對(duì)照組增多（圖2）；慢性應(yīng)激組心室肌酪氨酸羥化酶含量（1 397.8±268.8）μm2/mm2較對(duì)照組（995.0±232.3 ）μm2/mm2增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 兩組心室肌切片Masson染色圖片（×400）

圖2 兩組心室肌切片免疫組化圖片（×400）

3 討論

盡管流行病學(xué)資料顯示長(zhǎng)期慢性應(yīng)激的存在會(huì)促進(jìn)心臟疾病的發(fā)生，但其具體的致病機(jī)制并不十分清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示慢性應(yīng)激可導(dǎo)致心率變異性下降，心肌纖維化加重，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)受損，從而促進(jìn)心律失常的發(fā)生[8]。臨床發(fā)現(xiàn)存在情緒應(yīng)激的患者，多伴有心臟交感神經(jīng)功能亢進(jìn)[9]。心臟交感神經(jīng)密度增加則促進(jìn)了室性心律失常的發(fā)生[10]。焦慮抑郁情緒可能加重炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮功能損害[11]，而抗抑郁藥物能夠減少室性心律失常的發(fā)生[12]。為此我們擬通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激程序建立模型，采用心臟電生理及免疫組化等手段探討慢性應(yīng)激與心律失常相關(guān)性及其可能存在的機(jī)制。

研究模型參照Willner等的研究，糖水偏愛比的下降提示快感缺乏，而曠場(chǎng)相關(guān)指標(biāo)的下降顯示自發(fā)活動(dòng)減少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激組大鼠糖水偏愛比及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均顯著降低（P＜0.01），表明本實(shí)驗(yàn)慢性應(yīng)激性刺激具有可行性、可靠性、有效性[6, 13-15]。

交感神經(jīng)興奮最直接的反應(yīng)是心率增快，而血壓更多受心輸出量、外周血管阻力、內(nèi)分泌影響。本實(shí)驗(yàn)在麻醉狀態(tài)下慢性應(yīng)激組心率較對(duì)照組加快（P＜0.01）,血壓無明顯差別，室性心律失常誘發(fā)率顯著升高（P＜0.01），提示慢性應(yīng)激組大鼠存在交感神經(jīng)功能亢進(jìn)。

交感神經(jīng)末梢與心肌形成突觸聯(lián)系，去甲腎上腺素是其釋放的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，交感神經(jīng)高支配現(xiàn)象的發(fā)生可誘導(dǎo)心肌對(duì)兒茶酚胺產(chǎn)生超敏現(xiàn)象，使心肌復(fù)極離散度增加，構(gòu)成觸發(fā)、啟動(dòng)，甚至維持惡性心律失常的重要機(jī)制[16]。

另有研究發(fā)現(xiàn)心臟交感神經(jīng)增生使心室肌瞬時(shí)外向鉀電流通道蛋白的表達(dá)減少，電流密度下降，從而引起復(fù)極延緩，導(dǎo)致心律失常易感性增加[17]。

酪氨酸羥化酶是兒茶酚胺合成的限速酶，本身具有不會(huì)接受吲哚的衍生物的性質(zhì)，因此具有高度的特異性，可以作為交感神經(jīng)特異性標(biāo)志物，慢性應(yīng)激大鼠心室肌中酪氨酸酶表達(dá)量的升高，提示心室交感神經(jīng)密度增加[18]。從而印證了我們的推論：慢性應(yīng)激通過影響心臟交感神經(jīng)重構(gòu)而增加了室性心律失常的易感性。

總而言之，越來越多的研究表明長(zhǎng)期慢性應(yīng)激已成為心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展重要因素之一。而慢性應(yīng)激引起交感神經(jīng)重構(gòu)的機(jī)制尚需更深層次的研究。對(duì)于心血管疾病患者，如何有效預(yù)防及治療慢性情緒應(yīng)激也應(yīng)引起我們的重視。

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Effect of Chronic Stress on Cardiac Sympathetic Nerve Function and Susceptibility of Ventricular Arrhythmia in Experimental Rats

SUN Li-fang, YANG Bo, SHI Shao-bo, LIU Tao, RUAN Bing, LIANG Jin-jun.
Department of Cardiology, Wuhan University People’s Hospital, Wuhan (430060), Hubei, China

Objective: To investigate the changes of cardiac sympathetic nerve function and susceptibility of ventricular arrhythmia at chronic stress condition in experimental rats.

Chronic mild stress; Ventricular arrhythmia; Sympathetic reconstruction

2014-09-04）

（編輯：王寶茹）

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（2014302020201）；湖北省基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2014CFA061）；國家自然科學(xué)基金（81200139）

430060 湖北省武漢市，武漢大學(xué)人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科

孫麗芳 碩士研究生 主要研究方向?yàn)樾穆墒СＱ芯?Email:summer19871105@163.com 通訊作者：楊波 Email:yybb112@whu.edu.cn

R54

A

1000-3614（2015）03-0272-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.018