徐 磊，賈玉堂＊，趙拴平，于春起，阮永明

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥230031；2.河北福成五豐食品股份有限公司，河北 三河065201）

對(duì)于高檔牛肉最直觀的指標(biāo)就是大理石花紋、肉色和脂肪顏色這三個(gè)方面，這三個(gè)指標(biāo)成為了各個(gè)國(guó)家牛肉分級(jí)的最重要組成部分。1995年Hayes在澳大利亞曾報(bào)道過(guò)在出口的胴體中黃色脂肪會(huì)降低10%的等級(jí)，如果有50%的黃脂，每年會(huì)減少澳大利亞肉牛業(yè)920萬(wàn)美元的收入；我國(guó)劉曉牧等在山東省部分屠宰企業(yè)的調(diào)查，每公斤高檔牛肉中，黃色脂肪的肉價(jià)格比白色脂肪低40元左右［1］。

牛肉黃脂主要是脂肪組織中的β－胡蘿卜素所導(dǎo)致的［2，3］，類胡蘿卜素是在植物中發(fā)現(xiàn)的一組化學(xué)復(fù)合物，在脂肪中占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的是β－胡蘿卜素和葉黃素，胡蘿卜素有很多種不同的同質(zhì)異構(gòu)體，全反式β－胡蘿卜素是在飼料作物中最常見(jiàn)的異構(gòu)體，也是牛體內(nèi)循環(huán)中主要的類胡蘿卜素［4］。近幾十年，對(duì)可能與牛肉脂肪顏色相關(guān)聯(lián)的候選基因的QTL進(jìn)行的檢測(cè)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效的QTL。Kruk的研究認(rèn)為在Jersey牛β－胡蘿卜素的沉積引起黃脂的過(guò)程中有一個(gè)主效基因在起作用，但卻沒(méi)有找出這個(gè)主效基因［5］。由于β－胡蘿卜素是牛肉黃脂的主要貢獻(xiàn)者，可以對(duì)β－胡蘿卜素代謝中的酶進(jìn)行研究來(lái)探索牛肉黃脂的遺傳機(jī)制。

本研究為了研究牛肉脂肪顏色與β－胡蘿卜素雙脫氧加氫酶（BCO2）基因的關(guān)系，選擇品種、年齡和飼養(yǎng)條件相似的西門(mén)塔爾牛73頭，在屠宰時(shí)采集組織樣品待提取基因組DNA，在胴體排酸48小時(shí)后測(cè)定皮下脂肪顏色數(shù)據(jù)。根據(jù)已發(fā)布的BCO2基因序列設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)試驗(yàn)牛的BCO2基因的多態(tài)性，結(jié)合皮下脂肪顏色數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，以檢驗(yàn)肉牛BCO2基因多態(tài)性與牛肉黃脂肪的關(guān)系，為肉牛脂肪顏色等級(jí)的分子輔助選擇提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在河北三河市福成肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)，選擇2－3歲西門(mén)塔爾牛88頭，為同場(chǎng)同樣飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下育肥肉牛，在福成肉牛屠宰場(chǎng)屠宰時(shí)采集新鮮肌肉組織0.5g置75%酒精中－20℃保存待用。胴體排酸48h后，在皮下脂肪切一新鮮切面，用佳能CR－S4w手持式色差儀測(cè)色差3次，取平均值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 使用天根生物的組織基因組DNA提取試劑盒提取，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度并調(diào)整到50ng／μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)GenBank公布的BCO2基因序列（登錄號(hào)：NC＿007313），利用Primer5軟件設(shè)計(jì)5對(duì)引物，引物由上海銆尚生物技術(shù)有限公司合成。引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度、反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 采用降落式PCR，反應(yīng)體系均為15μL：含核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer（含15mmol／L的 Mg2＋）的 Mix 7.5μL，5mol／μL的混合引物（上下游引物濃度均為10pmol／μL）0.6μL，DNA 模板1μL，ddH2O 5.9 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度開(kāi)始為60℃，每循環(huán)降低1℃，10個(gè)循環(huán)降到50℃后，再以50℃的退火溫度進(jìn)行24個(gè)循環(huán)），72℃延伸50s；72℃最終延伸10min，4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，隨機(jī)選取20頭西門(mén)塔爾雜交牛BCO2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至銆尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，雙向測(cè)通。

1.2.4 PCR－RFLP檢測(cè) 測(cè)序結(jié)果用 DNAStar軟件來(lái)進(jìn)行分析校正，用watcut在線工具查找酶切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)查找，用限制性內(nèi)切酶Bsr1對(duì)肉牛BCO2基因P1引物的的PCR產(chǎn)物（525bp）進(jìn)行酶切，用限制性內(nèi)切酶ScrFI對(duì)肉牛BCO2基因P4引物的的PCR產(chǎn)物（351bp）進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系均為：PCR產(chǎn)物6μL，10×NEB Buffer 1.5μL，內(nèi)切酶1μL，雙蒸水6.5μL，共15μL。酶切反應(yīng)溫度水浴4h，酶切結(jié)束后用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分型。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與相關(guān)性分析 等位基因頻率、基因型頻率等數(shù)據(jù)計(jì)算使用PopGene軟件計(jì)算，運(yùn)用excel軟件對(duì)脂肪顏色數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)ab數(shù)據(jù)，用SAS 9.0（StatisticalAnalysis System）軟件的GLM程序?qū)ι顢?shù)據(jù)的b＊值與基因型進(jìn)行相關(guān)分析，用最小二乘法根據(jù)下列模型進(jìn)行檢驗(yàn)：

Yij＝μ＋Gi＋eij

式中為Yij表型值；μ為群體平均值；Gi為第i種基因效應(yīng)；eij為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪顏色檢測(cè)結(jié)果

色差儀導(dǎo)出的色差值為XYZ數(shù)據(jù)格式，用excel轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)BA格式，部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果如下：

注：L＊表示亮度，a＊表示紅度，b＊表示黃度，因此在對(duì)黃脂進(jìn)行分析時(shí)，本試驗(yàn)采用b＊值來(lái)代表黃脂的程度。

2.2 RFLP分析結(jié)果

本研究所采取的西門(mén)塔爾雜交?；蚪MDNA的提取及BCO2基因各引物的擴(kuò)增結(jié)果良好，可以用于測(cè)序和酶切反應(yīng)。為了檢測(cè)西門(mén)塔爾雜交牛BCO2基因的多態(tài)性，隨機(jī)選取了20份DNA樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)用Clustalx軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)：P1產(chǎn)物的第111bp的堿基的A到G的突變；P3產(chǎn)物第76bp的堿基A到G的突變，依次稱為標(biāo)記BV1和標(biāo)記BV2。

分別對(duì)BV1和BV2進(jìn)行PCR－RFLP鑒定，根據(jù)測(cè)序結(jié)果和酶切鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)BV1位點(diǎn)存在3種基因型（GG基因型為391和134bp，AA基因型為391、107和27bp，AG基因型為391、134、107和27bp如圖2）。BV2位點(diǎn)存在3種基因型（II基因型為138、126和56bp，WW基因型為194和126 bp，IW 基因型為194、138、126和56bp，如圖3）。

圖4 BV1位點(diǎn)RFLP檢測(cè)結(jié)果電泳圖

圖5 BV2位點(diǎn)RFLP檢測(cè)結(jié)果電泳圖

2.3 BCO2基因標(biāo)記的多態(tài)性分析

在實(shí)驗(yàn)群體中，對(duì)BCO2基因BV1位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果表明，G等位基因是優(yōu)勢(shì)基因，而A等位基因頻率較低，BV1位點(diǎn)W等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因。（見(jiàn)表2、表3）。

表2 兩位點(diǎn)各基因型及頻率

表3 兩位點(diǎn)的遺傳多樣性分析

2.4 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

西門(mén)塔爾雜交牛BCO2基因的BV1標(biāo)記不同基因型對(duì)肉牛脂肪顏色影響的關(guān)聯(lián)分析中，AA基因型肉牛脂肪顏色最小二乘均值為21.168，GG基因型為16.599，顯著極顯著（P＜0.01），可以判斷BCO2基因的多態(tài)性對(duì)脂肪顏色有顯著的影響，其中BV1的AA基因型容易導(dǎo)致黃脂，而GG基因型牛脂肪顏色得分較高。（見(jiàn)表4）。

表4 BCO2基因BV1標(biāo)記不同基因型與脂肪顏色色差數(shù)據(jù)中b＊值最小二乘分析結(jié)果

西門(mén)塔爾雜交牛BCO2基因的BV2標(biāo)記不同基因型對(duì)肉牛脂肪顏色影響的關(guān)聯(lián)分析中，II基因型肉牛脂肪顏色最小二乘均值為15.425，WW基因型為14.048，差異不顯著（P＞0.05），這表明脂肪顏色在BV2的三種基因型間差異不顯著。（見(jiàn)表5）。

表5 BCO2基因BV1標(biāo)記不同基因型與脂肪顏色色差數(shù)據(jù)中b＊值最小二乘分析結(jié)果

3 討論

在動(dòng)物體內(nèi)，β－胡蘿卜素氧化合成為維生素A有兩種方式：對(duì)稱裂解和非對(duì)稱裂解。對(duì)稱裂解由β，β－胡蘿卜素15，15＇－加氧酶（BCMO1）催化，生成視黃醛和維甲酸；非對(duì)稱裂解是由β－胡蘿卜素9＇，10＇－雙加氧脫氫酶（BCO2）催化，產(chǎn)生β－紫羅酮和兩分子的β－阿樸胡蘿卜素醛。在脊椎動(dòng)物中，維生素A衍生物的生物合成中，β－胡蘿卜素的哪種裂解是主要方式也是一個(gè)長(zhǎng)期爭(zhēng)論的話題［6］，結(jié)果表明，BCO2酶對(duì)β－胡蘿卜素有降解作用，與β－胡蘿卜素在脂肪中的沉積濃度有關(guān)系［7，8］，同時(shí)BCO2基因的表達(dá)與β－胡蘿卜素的沉積也有高度的相關(guān)性。這說(shuō)明調(diào)控維生素A合成通路的BCO2基因的表達(dá)水平對(duì)β－胡蘿卜素在皮下脂肪組織中的沉積有重要的影響作用，它們也就可能影響牛肉的脂肪顏色。通過(guò)RT－PCR研究，發(fā)現(xiàn)在鼠的腸、肝、腎和睪丸組織中的表達(dá)水平高度穩(wěn)定，在脾、腦、心臟和肺組織表達(dá)水平很低［9］，VonLintig等［10］在人體的骨骼肌中也發(fā)現(xiàn)了BCO2基因的mRNA。在敲除了BCMO1基因的小鼠體內(nèi)，內(nèi)臟脂肪中BCO2的mRNA表達(dá)水平卻沒(méi)有變化，Hessel等［11］在已經(jīng)檢測(cè)過(guò)沒(méi)有BCMO1酶活力的情況下，維生素A缺乏不會(huì)影響B(tài)CO2酶在人體的不同的組織和細(xì)胞中的表達(dá)［12］。這些結(jié)果表明調(diào)控維生素A和乳酸合成通路的基因的表達(dá)水平對(duì)β－胡蘿卜素在皮下脂肪組織中的沉積有重要的影響作用，它們也就能影響牛肉的脂肪顏色［13］。

本研究利用直接測(cè)序和PCR－RFLP技術(shù)研究了西門(mén)塔爾牛BCO2基因的變異，分析了其與牛脂肪顏色性狀的關(guān)系。在BCO2基因上發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，分別命名為BV1、BV2。在兩個(gè)位點(diǎn)都各有三種基因型，且都以GG型為主。在關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)BV1位點(diǎn)與肉牛皮下脂肪顏色具有顯著相關(guān)性，其三種基因型的牛肉脂肪顏色差異顯著（P＜0.01），AA基因型脂肪黃脂得分較高。

4 結(jié)論

通過(guò)本研究和國(guó)內(nèi)外其他的研究可以看出BCO2基因與西門(mén)塔爾肉牛脂肪顏色有著關(guān)聯(lián)性，因此本研究認(rèn)為BCO2基因可以作為與肉牛脂肪顏色性能有關(guān)的候選基因。在肉牛育種實(shí)踐中，可利用BCO2基因作為分子標(biāo)記經(jīng)行人工選擇降低群體中劣勢(shì)基因型個(gè)體的比例，以提脂肪顏色等級(jí)，改善牛肉等級(jí)。本研究檢測(cè)了到了與肉牛脂肪顏色性能相關(guān)的標(biāo)記BV1，此變異位點(diǎn)可以作為分子標(biāo)記而應(yīng)用，可以提高肉牛脂肪顏色等級(jí)的輔助選擇的分子標(biāo)記。

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