陳 華

(江蘇省淮安市金湖縣動物疫病預(yù)防控制中心,江蘇淮安 211600)

溫度對血凝和血凝抑制試驗(yàn)的影響

陳 華

(江蘇省淮安市金湖縣動物疫病預(yù)防控制中心,江蘇淮安 211600)

禽流感病毒、新城疫病毒能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集(HA)現(xiàn)象,這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性抗血清所抑制(HI)。血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)可以用來鑒定病毒亞型,也可以用來判定疫苗免疫效果?，F(xiàn)就20～25℃、37℃對血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)的影響作個比較。

血凝抑制試驗(yàn);影響

1 材料與試劑

（1）96孔V型微量血凝移液器（配有滴頭）、微量振蕩器、普通離心機(jī)

（2）試劑 0.85%滅菌生理鹽水、新鮮1%雞紅細(xì)胞懸液、標(biāo)準(zhǔn)禽流感H5病毒抗原、標(biāo)準(zhǔn)禽流感H5陽性血清、50份待檢雞血清。

2 操作方法和結(jié)果判定

（1）20～25℃下血凝（HA）試驗(yàn)：測標(biāo)準(zhǔn)禽流感H5病毒抗原的血凝價。

①在V型微量反應(yīng)板的1孔---12孔均加入0.025ml生理鹽水。

②吸取0.025ml H5病毒懸液，加入第1孔，混勻。

③從第1孔取0.025ml病毒懸液加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至11孔，從第11孔吸取0.025ml棄之。

④每孔再加入0.025ml生理鹽水。

⑤每孔均加入0.025ml充分搖勻的1%雞紅細(xì)胞懸液。

⑥震蕩混勻，在20～25℃下靜置40分鐘后觀察結(jié)果。

⑦結(jié)果判定：觀察紅細(xì)胞，對照紅細(xì)胞將成明顯的鈕扣狀沉到孔底，將血凝板傾斜，有淚滴狀流淌3孔，判定該標(biāo)準(zhǔn)禽流感H5病毒抗原的血凝價為29。

（2）20～25℃下血凝抑制（HI）試驗(yàn)：測待檢血清的H5血凝效價。

①根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)29作為終點(diǎn)，29除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)，即以1：128稀釋后即為4HAU抗原。

②在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入0.025ml、第12孔加入0.05ml生理鹽水。

③吸取0.025ml血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸取0.025ml，于第2孔依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025ml棄之。

④1～11孔加入含4HAU的H5病毒抗原液0.025ml，震蕩混勻，于室溫（約20～25℃℃）靜置30民，

⑤每孔加入0.025ml1%紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，室溫（約20～25℃）靜置40min。

⑥結(jié)果判定：將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無淚滴狀流淌。對照陰陽性血清孔效價，以完全抑制4個HAU抗原的血清最高倍數(shù)作為HI滴度。50份待檢血清的H5血凝價見下表：

⑦判定結(jié)果后，繼續(xù)將血凝板放室溫（約20～25℃）中，每隔15min，觀察試驗(yàn)變化。隨著時間的不斷延長，紅細(xì)胞淚滴狀流淌越來越清淅，最后紅細(xì)胞完全解脫。

（3）37℃下血凝（HA）試驗(yàn)：測標(biāo)準(zhǔn)禽流感H5病毒抗原的血凝價。

步驟①②③④⑤同（1）

⑥震蕩混勻，在37℃下靜置15min后觀察結(jié)果。

板號 樣品編號 血凝價 備注 板號 樣品編號 血凝價 備注1 274 1 26 262 28 27 263 28 28 274 28 29 295 27 30 296 27 31 287 27 32 288 2833 289 26 34 2710 26 35 2911 26 36 2912 26 37 2913 26 38 2914 28 39 21015 28 40 2916 285 2 41 2949 294 25 28 50 293 17 27 42 2918 27 43 2819 27 44 2920 27 45 2821 28 46 2922 27 47 2923 28 48 2824 287 6

⑦結(jié)果判定：觀察紅細(xì)胞，對照紅細(xì)胞將成明顯的鈕扣狀沉到孔底，將血凝板傾斜，有淚滴狀流淌3孔，判定該標(biāo)準(zhǔn)禽流感H5病毒抗原的血凝價為29。

（4）37℃下血凝抑制（HI）試驗(yàn)：測待檢血清的H5血凝效價。

步驟①②③同（2）

④1～11孔加入含4HAU的H5病毒抗原液0.025ml，震蕩混勻，37℃靜置15min。

⑤每孔加入0.025ml1%紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，37℃靜置15min。

⑥結(jié)果判定：將血凝板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無淚滴狀流淌。對照陰陽性血清孔效價，以完全抑制4個HAU抗原的血清最高倍數(shù)作為HI滴度。50份待檢血清的血凝價見下表：

（備注中+1、-1表示與20℃-25℃時血凝價的差異）

⑦判定結(jié)果后，繼續(xù)將血凝板放入37℃溫箱中，每隔15分鐘，觀察血凝價的變化。很快紅細(xì)胞就出現(xiàn)解脫。

3 結(jié)果分析

①在室溫（20～25℃）和溫箱（37℃）這兩種不同溫度下，50個樣品中，只有6個樣品的滴度變化在1個滴度內(nèi)。因此血凝和血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果在這兩個溫度下沒有顯著差別。

②在室溫（20～25℃）條件下，HI滴度隨作用時間的延長而升高，溫度低，遞增慢，達(dá)到HI最高值的所需時間長；試驗(yàn)判定等待時間較長（40min），而在溫箱（約37℃），溫度高，HI滴度遞增快，達(dá)到最高值所需時間短。試驗(yàn)判定等待時間較短（15min）。

③室溫（20～25℃）條件下，試驗(yàn)結(jié)果維持的時間長，不易引起因紅細(xì)胞解脫而影響結(jié)果判定。37℃時，若不及時從溫箱中拿出血凝板，很容易因溫度高時間長而出現(xiàn)紅細(xì)胞解脫，影響試驗(yàn)結(jié)果判定。

③在血清樣品數(shù)較少、需要快速診斷抗體水平時，可將試驗(yàn)溫度調(diào)到37℃。在這個溫度下，可快速得出血清的抗體水平，有助于提高工作效率。

④在血清樣品數(shù)較多、不需要快速診斷抗體水平時，可將試驗(yàn)溫度調(diào)到25℃。在這個溫度下，較多的樣品判定結(jié)果時，不會因判定持續(xù)時間較長而影響結(jié)果。

[1] 李曉華.血凝抑制試驗(yàn)的影響因素[J].龍巖學(xué)院學(xué)報，2004，（3）：78.