許智慧，劉 妍，徐東平

·導(dǎo)向與述評·

針對不同靶點的抗HBV新藥研究進展

許智慧，劉 妍，徐東平

目前臨床上應(yīng)用的抗HBV治療藥物主要有干擾素和核苷（酸）類似物二類，干擾素的不良反應(yīng)、長期使用核苷（酸）類似物引起的HBV耐藥和停藥復(fù)發(fā)仍是臨床面臨的問題，尤其是即使經(jīng)過長期治療后大多數(shù)慢性HBV感染者的病毒仍不能被徹底清除。因此，研發(fā)針對不同靶位的抗HBV新藥意義重大。通過聯(lián)合應(yīng)用針對不同靶點的抗HBV藥物，將來有可能獲得與抗HCV治療相似的病毒清除效果。本文就針對不同靶點的抗HBV新藥的研究進展進行綜述。

乙型肝炎病毒；抗病毒藥；治療學

全世界約20億人曾感染過HBV，其中約2.4億為慢性HBV感染者，每年有超過50萬人死于HBV感染所導(dǎo)致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌[1]。臨床上應(yīng)用的抗HBV治療藥物主要有干擾素（interferon,IFN）和核苷（酸）類似物二類。IFN有不良反應(yīng)大、應(yīng)答率低等缺點。乙型肝炎（乙肝）患者長期使用核苷（酸）類似物引起的HBV耐藥和停藥復(fù)發(fā)仍是臨床抗病毒治療面臨的主要問題，尤其是即使經(jīng)過核苷（酸）類似物長期治療后大多數(shù)慢性HBV感染者的病毒仍不能徹底清除。因此，研發(fā)針對不同靶位的抗HBV新藥意義重大。本文針對目前HBV不同生活周期的抗病毒用藥進行綜述。

1HBV的生命周期

HBV進入人體，病毒包膜表面上大蛋白（L蛋白）N端的27～46位氨基酸就與肝細胞膜上的鈉離子——牛磺膽酸協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（NTCP）結(jié)合[2]，病毒顆粒通過受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用進入細胞，再由細胞微管系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至核孔復(fù)合物。HBV核心顆粒是由240個由2個核心蛋白形成的二聚體亞單位按一定的空間順序結(jié)合形成的對稱的二十面體結(jié)構(gòu)。核心蛋白經(jīng)未知的磷酸化機制在細胞核內(nèi)定位，核心蛋白與核孔復(fù)合物結(jié)合而脫去病毒核衣殼后HBV DNA進入細胞核內(nèi)，HBV由內(nèi)吞到入細胞核過程需要細胞內(nèi)GTP激酶信號途徑的參與。HBV DNA經(jīng)一系列環(huán)節(jié)修復(fù)缺口形成超共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。

細胞內(nèi)RNA多聚酶Ⅱ以cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBV的各種mRNA。HBV DNA聚合酶（P蛋白）結(jié)合于前基因組RNA（pgRNA，即3.5 kb mRNA）5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，促使pgRNA包裹入核心顆粒中，P蛋白TP區(qū)第63位酪氨酸殘基上的羥基與GTP共價結(jié)合引發(fā)合成5′-GAAT-3′的四聚DNA引物，P蛋白與該引物轉(zhuǎn)位到pgRNA 3′端DR1區(qū)，以pgRNA為模板轉(zhuǎn)錄合成互補性負鏈DNA，同時DNA聚合酶的核糖核酸酶H切割模板pgRNA，僅保留5′端完整的DR1片段，與該片段互補的短小RNA脫離并附著在負鏈5′端，并引導(dǎo)正鏈合成。當合成延伸到負鏈5′端時，DNA聚合酶模板切換至負鏈3′端繼續(xù)合成正鏈DNA，形成松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA,rcDNA）。正鏈合成啟動時，核心顆粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可與表面抗原相互識別，以出芽生殖的方式形成完整病毒顆粒。包裹著衣殼的HBV DNA可以由表面抗原包裹后分泌到細胞外，也可以重新脫去核衣殼進入細胞核內(nèi)，以維持細胞核內(nèi)cccDNA的數(shù)量。

2作用于HBV靶點的新藥研究策略

新藥的靶點針對HBV生命周期中的吸附和進入、胞內(nèi)脫核衣殼、cccDNA形成、核酸復(fù)制和蛋白合成、病毒顆粒組裝和釋放等各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.1針對HBV吸附和進入研究表明，環(huán)孢素（ciclosporin）、哇巴因（ouabain）、維庫溴銨（vecuronium）、孕烯醇酮硫酸酯（pregnenolone sulfate）、布美他尼（bumetanide）、厄貝沙坦（irbesartan）和依澤替米貝（ezetimibe）等可下調(diào)NTCP，進而干擾膽汁酸的轉(zhuǎn)運[3]。此外，雌激素（estrogen）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）α、白細胞介素（interleukin, IL）-1、IL-6等均可下調(diào)人肝細胞膜表面NTCP的表達，其中以IL-1的作用最為明顯，但這些因素是否對肝細胞感染HBV具有保護作用尚需相關(guān)研究進一步明確[4]。目前針對NTCP的進入型抑制劑有Myrcludex B，該藥物是Vision 7 GmbH公司研制的乙?；疨reS1短肽，是第1個強力HBV入胞抑制劑。Myrcludex B在合適的治療濃度下，可阻斷HBV進入肝細胞，且不影響NTCP的膽汁酸轉(zhuǎn)運功能[5-6]。環(huán)孢素及其衍生物和依澤替米貝可抑制人肝細胞膜表面的NTCP，不僅可以抑制膽酸轉(zhuǎn)運，而且同時抑制HBV進入肝細胞。Nkongolo等[7]體外實驗表明，環(huán)孢素可通過直接下調(diào)肝細胞膜表面的NTCP來阻斷HBV進入肝細胞。而對于IL-6在HBV感染中發(fā)揮的作用存在2種觀點，一種觀點認為IL-6可能是介導(dǎo)HBV感染的受體，另一種觀點認為IL-6可通過下調(diào)HBV受體NTCP的表達而抑制HBV感染。2015年Bouezzedine等[8]在研究IL-6對HBV進入過程的影響中發(fā)現(xiàn)，體外預(yù)給予IL-6對HBsAg分泌的抑制率可達90％，且細胞內(nèi)HBV的cccDNA也顯著降低，同時NTCP的mRNA水平降低98％，NTCP介導(dǎo)的?；悄懰釘z取減少80％，且IL-6對NTCP及其攝取的抑制均具有劑量依賴性。

2.2針對HBV病毒脫殼HBV是包膜病毒，目前脫殼的具體過程尚未闡明，但病毒顆粒以融合形成內(nèi)吞體的方式進入細胞，可能是隨著內(nèi)吞體pH值的降低，包膜蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，HBV病毒包膜與內(nèi)吞體膜融合，釋放到細胞質(zhì)中。內(nèi)吞作用、內(nèi)吞體與HBV病毒包膜的融合已被提議作為潛在的用藥途徑[9]。

2.3針對HBV核酸復(fù)制臨床應(yīng)用核苷（酸）類DNA聚合酶抑制劑治療HBV感染已有17年歷史，治療藥物有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定、克拉夫定、恩曲他濱和替諾福韋酯（TDF）等。TDF首先用于治療HIV感染，后發(fā)現(xiàn)有顯著的抗HBV活性[10]，臨床試驗證明其對各種基因型（A～H）HBV以及LAM耐藥株同樣有效[11]。核苷（酸）類似物是通過競爭性地與酶結(jié)合來抑制病毒復(fù)制，優(yōu)點是抑制病毒效果好，但由于其不能直接抑制cccDNA，停藥后易出現(xiàn)反彈，此外耐藥和應(yīng)答不佳也是臨床面臨的問題。

2.4針對cccDNA及HBVmRNA生成cccDNA是HBV活躍復(fù)制狀態(tài)的重要指標，目前主要治療策略是針對于HBV cccDNA或mRNA進行基因治療。①反義RNA通過激活RNase，抑制病毒mRNA的起始部位與啟動蛋白及核糖體的結(jié)合，阻斷mRNA成熟等多個環(huán)節(jié)，從而阻斷mRNA的翻譯過程。Starkey等[12]實驗證實RNAi抗HBV藥物能夠抑制病毒RNA、病毒蛋白與病毒粒子的形成，但對cccDNA影響不大。②目前，以cccDNA作為靶點的序列特異性DNA結(jié)合蛋白及其衍生物主要有3種，一是核酸內(nèi)切酶，把一些核酸內(nèi)切酶改造成針對12～40 bp DNA序列起作用的DNA結(jié)合蛋白；二是鋅指核酸酶，設(shè)計合成多趾鋅指蛋白，每個鋅指能綁定到1個特定的核苷酸三聯(lián)體，當1個多趾鋅指蛋白包括4個鋅指時，每1個L或R亞基的目標是1個12 bp序列；三是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALENs），把TALENs改造成靶向結(jié)合19 bp DNA序列的DNA結(jié)合蛋白[13]。③CRISPR/Cas9酶系統(tǒng)作為近年發(fā)展的DNA編輯新技術(shù)也被用于抗HBV新藥研究，代表性技術(shù)是其由DNA切割酶Cas9和一段與靶DNA片段匹配的20個核苷酸長度的短RNA片段構(gòu)成。它的特點在于只須合成一個gRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas9蛋白不具特異性；編碼gRNA的序列不超過100 bp，構(gòu)建較簡單、方便。Zhen等[14]發(fā)現(xiàn)靶定HBsAg編碼區(qū)的CRISPR/Cas9酶系統(tǒng)處理后，細胞培養(yǎng)基和小鼠血清HBsAg水平顯著降低，小鼠肝臟組織中HBsAg陽性細胞顯著減小。因此，CRISPR/Cas9酶系統(tǒng)可能是一種有效抑制HBV復(fù)制的技術(shù)。④最近研究顯示IFN α和另外一種潛在的細胞因子淋巴毒素-β（LT-β）可以介導(dǎo)APOBEC3蛋白家族中的APOBEC3A和APOBEC3B分泌，從而誘發(fā)感染cccDNA的肝細胞退化[15-17]。

2.5針對HBV病毒組裝HBV衣殼由核心蛋白裝配而成。3個核心蛋白二聚體聚集為核，組成二十面體衣殼蛋白。在反轉(zhuǎn)錄以前，HBV反轉(zhuǎn)錄酶，pgRNA須被衣殼蛋白正確包裹。因此，阻斷衣殼蛋白裝配，或加快衣殼蛋白降解，都會阻斷衣殼裝配過程，從而影響HBV復(fù)制。目前，針對這一靶點設(shè)計的藥物主要有2類：heteroaryldihydropyrimidines（HAPs）和phenylpropenamides。①HAPs類藥物：Bay化合物是由德國拜爾公司開發(fā)的HAPs類乙肝治療藥物。以Bay41-4109為例，3～30 mg/(kg·d)的劑量給HBV轉(zhuǎn)基因小鼠服用，小鼠肝臟和血液中病毒DNA含量降低程度與LAM對照組接近；但是，Bay41-4109組小鼠肝臟中HBcAg表達受到抑制[18]，說明Bay41-4109與傳統(tǒng)抗乙肝藥物的作用機制可能不同。在體外實驗中，以Bay41-4109、Bay38-7690、Bay39-5493等為代表的HAPs類化合物能夠抑制HBV衣殼蛋白的形成，加速核心蛋白降解。HAPs類另一個代表藥物是GLS4。該藥是中國廣東東陽光藥業(yè)有限公司研發(fā)的抗乙肝新藥，目前正在Ⅰ期臨床試驗中。GLS4對HepG2.2.1.5細胞中HBV DNA復(fù)制的半抑制濃度（half inhibitory concentration,IC50）達到了0.012 μmol/L，比Bay41-4109活性更高，用透射電鏡與動態(tài)光散射法檢測到大量異常結(jié)構(gòu)的衣殼蛋白。此外，對HBV的ADV耐藥變異株rtA181T、rtA181V和rtN236T也對GLS4的作用敏感[19]。②phenylpropenamides類藥物：AT-61對HBV pgRNA裝配進入衣殼蛋白過程起阻斷作用[20]，在HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系Hep－AD38、HepAD79、HepG2.2.15和瞬轉(zhuǎn)HBV DNA的HepG2細胞中病毒DNA的IC50為0.6～5.7μmol/L。＞27 μmol/L的劑量能抑制HepAD38細胞核中99％以上的cccDNA，且不影響病毒RNA的表達。Delaney等[21]的研究將另一種phenylpropenamides類藥物AT-130與AT-61進行了活性比較，二者對瞬轉(zhuǎn)野生型HBV DNA的HepG2細胞中病毒DNA的IC50分別是2.4、21.2 μmol/L。當AT-130與AT-61濃度為250 μmol/L時，對HepG2和Huh7均無毒性，同時，二者對LAM耐藥的HBV變異株（rtM204I±rtL180M和rtL180M┼rtM204V）也有較好的抑制作用。AT-61和AT-130都具有體外抑制肝細胞中HBV復(fù)制的作用，后者效果更好。Cai等[22]研究發(fā)現(xiàn)磺胺類替代物CCC-0975和CCC-0346可抑制HBV rcDNA轉(zhuǎn)化成cccDNA。

2.6針對HBV病毒釋放HBV的形態(tài)發(fā)生和釋放同樣可以作為抗病毒的新靶點。3種HBV包膜蛋白（L、M和S蛋白）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，它們不僅參與病毒成熟核心顆粒的包膜化過程，還與成熟病毒的釋放有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)的苯并咪唑類衍生物BM601在不影響HBeAg、宿主蛋白分泌和細胞應(yīng)激反應(yīng)的情況下，干擾表面抗原在高爾基體的聚集從而抑HBV病毒顆粒和HBsAg的分泌[23]。也有研究證明N-丁基脫氧野艽霉素可抑制包膜蛋白糖基化修飾過程中的葡萄糖苷酶，導(dǎo)致HBV包膜蛋白的錯誤折疊，進而抑制病毒顆粒的組裝和釋放[24]。Abdul等[25]研究證明陽離子細胞穿透肽可以造成包膜蛋白成簇聚集，影響核心顆粒的包被，從而阻止病毒的釋放。目前針對不同HBV靶點的代表性前體新藥研發(fā)情況見表1。

表1 針對HBV靶點的前體新藥及作用機制Table 1Novel anti-HBV agents against various viral targets and their mechanisms

3針對提高機體抗HBV免疫反應(yīng)的策略

關(guān)于提高機體抗HBV免疫反應(yīng)的代表性前體新藥（表2）熱點主要有：①Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）口服激動劑，主要是TLR7和TLR9激性死亡分子配體（PD-L1）抗體、抗CTL相關(guān)抗原4（CTLA-4）抗體；③特異性CTL調(diào)節(jié)分子激動劑或佐劑，例如IL-21；④治療性疫苗，包括抗原疫苗、抗體復(fù)合物疫苗、DNA疫苗、CTL表位多肽疫苗、樹突狀細胞疫苗等；⑤特異性T細胞受體（T cell receptor,TCR）轉(zhuǎn)基因技術(shù)；⑥嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor,CAR）T細胞（CAR-T）技術(shù)。

表2 針對提高機體抗HBV免疫反應(yīng)的前體新藥Table 2Novel anti-HBV agents with augmentation of antiviral immune responses

Lanford等[26]和Lopatin等[27]利用慢性HBV感染的黑猩猩作為研究模型，發(fā)現(xiàn)短期口服小分子的TLR7激動劑可以誘導(dǎo)IFN α產(chǎn)生，激活I(lǐng)FN刺激因子及自然殺傷細胞（natural killer cell,NK細胞）和淋巴細胞亞群，從而激活黑猩猩免疫細胞中的TLR7信號，而降低血清和肝臟中的HBV DNA水平，減少肝臟中HBV抗原陽性的細胞。TLR9激動劑（1018 ISS）作為疫苗佐劑已用于臨床試驗[28]。有研究表明慢性乙肝（chronic hepatitis B,CHB）患者由于肝臟內(nèi)缺陷的抗原呈遞系統(tǒng)使大部分T淋巴細胞處于無功能狀態(tài)，促凋亡分子BIM表達增多介導(dǎo)特異性CD8+T淋巴細胞凋亡，共刺激分子如抗程序性死亡分子（PD-1）/PD-L1和CTLA-4表達增加，驅(qū)使T淋巴細胞功能喪失，以上證據(jù)均表明CHB患者特異性免疫力處于耗竭狀態(tài)，IL-12可通過提供CD8+T淋巴細胞活化所需的第三信號而修復(fù)CHB患者缺陷的T淋巴細胞，增強其細胞毒性作用及分泌抗病毒相關(guān)細胞因子能力，此外，IL-21在小鼠模型上顯示出具有抗HBV活性[29-30]；重組IL-7（CYT107）聯(lián)用TDF/ETV治療CHB已獲準進行Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗[31]。

提高抗HBV特異性免疫應(yīng)答的新療法主要包括治療性疫苗、樹突狀細胞疫苗、轉(zhuǎn)基因表達特異性CTL受體的細胞過繼免疫療法、抗PD-L1和抗CTLA-4抗體阻斷活化特異性CTL療法等[32]。此外，有研究表明用抗HBs-抗CD3雙特異性抗體，或用HBV包膜蛋白/CD3/CD28嵌合抗原受體轉(zhuǎn)基因表達可介導(dǎo)特異性殺傷，清除HBV感染肝細胞[33]。目前已開展了幾種治療性疫苗治療CHB的臨床試驗[34-42]，但報道的療效尚不理想。

新加坡Bertoletti課題組的研究表明，普通T淋巴細胞在轉(zhuǎn)基因表達HBV特異性CTL的TCR后，具備了特異性CTL的表型和功能特點，可針對抗原產(chǎn)生IFN、TNF α和IL-2等細胞因子，裂解HBV感染的肝樣細胞以及整合有HBV DNA的肝細胞癌細胞[43-44]。課題組應(yīng)用該方法治療了1例HBV相關(guān)肝細胞癌患者，患者接受治療1個月后HBsAg從3200 IU/ml下降到300 IU/ml，且發(fā)現(xiàn)輸入的特異性T淋巴細胞可以擴增，占CD8+T淋巴細胞的1.2％[45]。

CAR-T技術(shù)已從腫瘤治療領(lǐng)域擴展到治療持續(xù)性病毒感染[46]。CARs由TCR的胞內(nèi)信號區(qū)（如CD3ζ和CD28）、跨膜區(qū)以及胞外抗原結(jié)合區(qū)組成，而這個胞外區(qū)具有抗體單鏈可變區(qū)片段功能即識別特定腫瘤/病毒抗原的功能，這種CARs轉(zhuǎn)染的T淋巴細胞具有抗體的特異性和效應(yīng)T淋巴細胞的細胞毒作用。CAR-T技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域得到較好的發(fā)展和應(yīng)用，但仍存在細胞因子釋放綜合征、腫瘤溶解綜合征和脫靶效應(yīng)等須克服的問題，應(yīng)用于清除持續(xù)性病毒感染治療還需要大量的實驗數(shù)據(jù)。

4小結(jié)

盡管HBV感染本身沒有細胞毒作用，肝組織病理改變和肝損傷實際上是宿主免疫系統(tǒng)與受感染的肝細胞相互作用的結(jié)果，而這又取決于病毒復(fù)制水平高低和宿主免疫力強弱。這就要求我們既要研究病毒復(fù)制的具體機制，又要了解病毒進入人體后引發(fā)的免疫反應(yīng)。研究機體免疫應(yīng)答可幫助我們深入了解乙肝的慢性化機制，阻止乙肝惡化。

綜上所述，人們對慢性HBV感染的治療研究已取得了很大進展，但目前應(yīng)用于臨床的抗病毒藥物和治療方案尚須進一步完善，因此須要研發(fā)針對不同靶位的新型強效抗HBV藥物，為實現(xiàn)多靶位藥物聯(lián)合抗HBV治療奠定基礎(chǔ)，為慢性HBV感染性疾病的治療提供更多手段。

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（2015-08-24收稿 2015-09-16修回）

（責任編委 張玲霞 本文編輯 王 姝）

Advances in novel anti-HBV agents acting on different targets

XU Zhi-hui,LIU Yan,XU Dong-ping*
Research Center for Clinical Medicine,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China

There are two main categories of anti-HBV agents currently applied in clinical practice:interferons and nucleos(t)ide analogues.Adverse reactions of interferon,drug resistance induced by long-term use of nucleos(t)ide analogues and relapse off-therapy are problems confronted by clinicians.Especially,HBV cannot be eradicated in most patients even after long-term treatment. There-fore,it is significant to research and develop novel anti-HBV agents acting on different targets.The combination of multiple anti-HBV agents acting on different targets may achieve comparable"cure"effect as achieved in anti-HCV treatment.This article provides an overview of advances in novel anti-HBV agents acting on different targets.

hepatitis B virus;antiviral agents;therapeutics

R512.62；R978.7

A

1007-8134(2015)05-0000-00

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.05.000

國家“十二五”科技重大專項（2012ZX10004503）；國家自然科學基金面上項目（81171617、81371852）

100039北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心（許智慧、劉妍、徐東平）

徐東平，E-mail:xudongping302@sina.com

*Corresponding author,E-mail:xudongping302@sina.com