耿程欣，楊潤(rùn)強(qiáng)，顧振新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

活性化糙米富集γ-氨基丁酸的霧化液組分優(yōu)化

耿程欣，楊潤(rùn)強(qiáng)，顧振新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了糙米濕潤(rùn)活性化富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的霧化液pH值、VB6及CaCl2濃度，同時(shí)研究了最優(yōu)條件下活性化糙米谷氨酸脫羧酶活力及主要物質(zhì)含量變化。結(jié)果表明：最優(yōu)培養(yǎng)條件為霧化液pH 3.5、VB6濃度2 mmol/L和CaCl2濃度10 mmol/L；在此條件下，活性化糙米中GABA含量可達(dá)7.67 mg/100 g，為原料糙米的2.74 倍。隨著活性化時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中游離氨基酸、還原糖含量及谷氨酸脫羧酶活力呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，可溶性蛋白及淀粉含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明，GABA含量與谷氨酸、游離氨基酸、可溶性蛋白含量之間均顯著相關(guān)。

活性化糙米；γ-氨基丁酸；pH值；VB6；CaCl2

糙米是礱去谷殼后的稻米，具有生命活力。糙米由皮層、種皮、糊粉層、胚和胚乳等部分構(gòu)成，經(jīng)碾白后得到精白米，剔除的米糠包括種皮、糊粉層和部分胚。糙米富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素[1]，其中維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)和大部分蛋白質(zhì)存在于米糠中，淀粉則主要存在于胚乳中[2]。流行病學(xué)研究表明，長(zhǎng)期食用精白米易導(dǎo)致人體營(yíng)養(yǎng)素缺乏，造成心血管病等慢性疾病的發(fā)生。雖然食用糙米有助于人體健康，但由于其皮層的存在，糙米的蒸煮性與適口性差。發(fā)芽除了可以改善糙米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)外，還可以顯著提高γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等功能性物質(zhì)的含量[3]。

GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，作為哺乳動(dòng)物腦和脊髓中的一種抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)而存在，廣泛存在于植物[4]、動(dòng)物[5]和微生物[6]體內(nèi)，具有鎮(zhèn)定神經(jīng)、降低血壓、改善腦機(jī)能等作用[7]。以往的糙米采用浸泡發(fā)芽的方式富集GABA[8]，浸泡液pH值、磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）及Ca2＋濃度等因素顯著影響谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）活力，從而影響GABA的生成[9-10]。但是，將糙米浸泡于水中發(fā)芽，因其吸水速率過(guò)快[11]，發(fā)芽糙米干燥后大量爆腰，碾米時(shí)則碎米率高。對(duì)浸泡發(fā)芽后的糙米用蒸煮的方式使溶解的胚乳膠凝結(jié)，可降低碾米時(shí)碎米率，但是其工藝復(fù)雜[12]。在發(fā)芽過(guò)程中采用緩慢吸水方法[11]，不僅可以降低糙米吸水過(guò)快造成的裂紋，而且可以激活糙米內(nèi)源酶，以此富集功能成分。本實(shí)驗(yàn)采用霧化吸水方式，研究了由檸檬酸緩沖液、VB6（PLP替代物）和CaCl2組成的霧化液對(duì)糙米活性化及其富集GABA的影響，為開(kāi)發(fā)富含GABA的可碾白活性化糙米提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳稻種子品種為“武運(yùn)粳”，產(chǎn)自江蘇省南京市溧水區(qū)，收獲后于—20 ℃保存；實(shí)驗(yàn)前用礱谷機(jī)除去稻殼，得到糙米，然后剔除碎米粒、霉變粒、異色粒、無(wú)胚粒和未成熟籽粒，經(jīng)發(fā)芽率測(cè)試合格后，備用。

丙酮（色譜純） 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（色譜純） 美國(guó)西格瑪公司；乙酸、乙醇、茚三酮、考馬斯亮藍(lán)G-250、酒石酸鉀鈉等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JLMZJ礱米實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組合機(jī) 上海嘉定糧油檢測(cè)儀器廠；P YX-9030A型隔水電熱恒溫發(fā)芽箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；1200液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；402AI超聲波霧化器 江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；BG-LJ30OA多功能活氧機(jī) 北理國(guó)科臭氧應(yīng)用技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試材處理

定量稱取糙米（水分含量14%），用酸性霧化液在恒溫發(fā)芽箱內(nèi)霧化加濕，水分達(dá)到20%之前，培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為24 ℃，吸水速率控制在0.5%/h以下，環(huán)境濕度控制在75%以上（階段A）；之后設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為30 ℃，加濕至含水量26%，吸水速率控制在0.5%/h～1.2%/h，環(huán)境濕度控制在90%以上（階段B）；整個(gè)加濕時(shí)間為17～21 h。在加濕過(guò)程中，通入臭氧，以防止雜菌感染。

1.3.2 霧化液pH值的選擇

采用50 mmol/L的檸檬酸緩沖液為霧化加濕液：調(diào)節(jié)pH值分別為2.5、3.5、4.5、5.5和6.5，固定VB6濃度2 mmol/L、CaCl2濃度10 mmol/L，研究霧化液pH值對(duì)糙米活性化過(guò)程中GABA富集的影響。

1.3.3 VB6濃度的選擇

固定pH 3.5、CaCl2濃度10 mmol/L，設(shè)置VB6濃度為0、2、4、6、8 mmol/L，研究VB6濃度對(duì)活性化糙米GABA富集的影響。

1.3.4 CaCl2濃度的選擇

固定pH值及VB6濃度分別為3.5 mmol/L和2 mmol/L，設(shè)置CaCl2濃度為6、8、10、12、14 mmol/L，研究CaCl2濃度對(duì)活性化糙米GABA富 集的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)獲得霧化液最適pH值、VB6最適濃度和CaCl2最適濃度的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平L9（33）正交試驗(yàn)。

1.3.6 動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用上述試驗(yàn)中優(yōu)化出的條件對(duì)糙米加濕至水分含量為26%時(shí)需18.5 h，每隔4 h取樣一次，研究活性化過(guò)程中GABA、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、游離氨基酸、可溶性蛋白含量及GAD活力等指標(biāo)的變化。

1.3.7 指標(biāo)測(cè)定

含水率：采用質(zhì)量恒定法測(cè)定，以每克干基含水量表示；淀粉含量：按GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測(cè)定》[13]方法測(cè)定；可溶性蛋白含量：采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)；還原糖含量：采用3′5-二硝基水楊酸（3′5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[14]測(cè)定；游離氨基酸含量：采用茚三酮比色法[14]測(cè)定。

GABA及Glu含量：采用高效液相色譜法[15-16]測(cè)定：稱取糙米2.5 g→加入7%乙酸1 mL于研缽中→研成勻漿→轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中→再用7%乙酸提取液洗滌研缽2 次，每次2 mL，洗滌液亦轉(zhuǎn)入離心管→提取1 h→4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min→取上清液＋5 mL無(wú)水乙醇（沉淀多糖，4 ℃，至少2 h）→4 000 r/min離心20 min→上清液轉(zhuǎn)移至50 mL燒杯內(nèi)→于90 ℃水浴中蒸干（40 min）。溶于1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 9.0）中，取適量樣品溶液與等體積的氨基酸衍生劑（4 mg/mL的4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯丙酮溶液）混合，于67 ℃水浴中反應(yīng)10 min后立即置于冰浴中終止反應(yīng)，反應(yīng)液于6 000×g離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。

GAD活性：在文獻(xiàn)[17]基礎(chǔ)上略作修改。取1 g鮮樣，用5 mL 70 mmol/L的磷酸鉀緩沖溶液（pH 5.8，含有2 mmol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L EDTA、0.2 mmol/L PLP和10%丙三醇）研磨成勻漿后，于4 ℃、10 000×g離心20 min，上清液即為酶粗提液。取200 μL粗酶液和100 μL底物（1% Glu，pH 5.8），40 ℃反應(yīng)2 h后，90 ℃水浴10 min終止反應(yīng)?；旌衔锝?jīng)離心后，測(cè)定上清液中GABA含量。以每小時(shí)生成1 μmol GABA作為1 個(gè)活力單位（U）[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，各重復(fù)測(cè)定3 次，用Excel、SigmaPlot及SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 霧化液pH值對(duì)活性化糙米中GABA含量的影響

圖1 不同霧化液pH值條件下活性化糙米中GABA含量變化Fig.1 Change in GABA contents of activated brown rice at different pH values

由圖1可知，隨著霧化液pH值升高，GABA含量呈現(xiàn)先增加后逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為3.5時(shí)，活性化糙米中GABA的富集量最大，為原料的2.69 倍，比pH 5.5時(shí)高1.53 mg/100 g。GABA的生成需要消耗H＋，因而H＋濃度較高時(shí)有利于GABA生成[18]。植物中GAD最適pH值為5～6，浸泡發(fā)芽時(shí)將緩沖液的pH值調(diào)節(jié)至5～6有利于刺激植物體中GAD活性，以富集GABA；在此較低的pH值條件下，GABA轉(zhuǎn)氨酶（最適pH＞8）[10]活性較低，不利于GABA的轉(zhuǎn)氨，這有利于抑制GABA的分解。本實(shí)驗(yàn)采用微量吸水濕潤(rùn)發(fā)芽方法時(shí)，霧化液被緩慢滲入糙米內(nèi)部，因而需要更高的H＋濃度來(lái)激發(fā)GAD活性，使Glu脫羧，生成GABA?？梢?jiàn)，霧化液pH 3.5時(shí)有利于更多H＋進(jìn)入糙米內(nèi)部。盡管pH 2.5時(shí)H＋濃度較高，但酸度過(guò)大影響糙米的生命活力及GAD活性，因而pH 3.5為霧化液的適宜pH值。

2.2 VB6濃度對(duì)活性化糙米中GABA含量的影響

圖2 不同VVBB6濃度條件下活性化糙米GABA含量變化Fig.2 Change in GABA contents of activated brown rice at different VB6concentrations

由圖2可知，在檸檬酸霧化液中添加VB6有顯著提高活性化糙米中GABA含量的作用。VB6是磷酸吡哆醇、PLP及磷酸吡哆胺的復(fù)合物，與PLP對(duì)合成GABA的GAD活性有著同樣的作用[18]。GAD為PLP與蛋白質(zhì)的復(fù)合體，為PLP依賴型酶[10]。由于采用微量霧化吸水法，霧化液中的組分多停留在糙米粒表面，無(wú)法像浸泡發(fā)芽一樣快速進(jìn)入糙米中發(fā)揮作用。

2.3 CaCl2濃度對(duì)活性化糙米中GABA含量的影響

圖3 不同CCaaCCll2濃度條件下活性化糙米中GABA含量變化Fig.3 Change in GABA contents of activated brown rice at different CaCl2concentrations

由圖3可知，當(dāng)CaCl2濃度為10 mmol/L時(shí)GABA含量最高，而當(dāng)濃度為6、8、12、14 mmol/L時(shí)無(wú)顯著差異，且均 比濃度10 mmol/L略低。GABA支路中GAD為Ca2＋/鈣調(diào)蛋白（CaM）依賴性酶，Ca2＋有調(diào)節(jié)其活性、促進(jìn)GABA合成的作用[19]。

2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Orthogonal array results and analysislysis

表2 方差分析表Table2 Analysis of varianceiance

由表1可見(jiàn)，霧化液的pH值、VB6濃度、CaCl2濃度三因素對(duì)糙米發(fā)芽富集GABA影響大小順序依次為霧化液pH值＞CaCl2濃度＞VB6濃度。霧化液pH值對(duì)GABA含量影響在0.01水平上顯著，CaCl2濃度對(duì)GABA含量影響在0.05水平上顯著（表2）。糙米微量吸水富集GABA最適培養(yǎng)條件為：霧化液pH 3.5、VB6濃度2 mmol/L、CaCl2濃度10 mmol/L。

2.4.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以霧化液pH 5.5、VB6濃度2 mmol/L、CaCl2濃度10 mmol/L的隨機(jī)組合為對(duì)照，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)最佳組合處理得到的活性化米中GABA含量高于隨機(jī)組合，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table3 Results of validation experimentsments

2.5 動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

表4 糙米活性化過(guò)程中主要物質(zhì)含量和GAD活性變化Table4 Changes in main components contents and GAD activity during brown rice activaattiioonn

如表4所示，隨著加濕時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中GABA、Glu含量和GAD活性均呈上升的趨勢(shì)，GAD活性最后趨于平緩。大分子物質(zhì)如淀粉和蛋白質(zhì)逐漸分解成生命活動(dòng)需要的小分子物質(zhì)，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，游離氨基酸和還原糖含量變化比較平緩，總體呈上升趨勢(shì)。糙米發(fā)芽過(guò)程中，大量酶原被激活和釋放[20]，催化一系列生化反應(yīng)，將糙米中淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)分解，同時(shí)合成新的物質(zhì)，供生長(zhǎng)之用。本研究中僅對(duì)糙米進(jìn)行了霧化增濕處理，得到的活性化糙米吸水量遠(yuǎn)低于浸泡發(fā)芽的糙米，未長(zhǎng)出幼芽，因而淀粉和還原糖等碳水化合物、蛋白質(zhì)和游離氨基酸等含氮物質(zhì)的消耗較少。

2.6 活性化糙米中生理生化變化的相關(guān)性

從表5可以看出，糙米活性化過(guò)程中GABA、Glu、游離氨基酸、可溶性蛋白主要物質(zhì)含量之間均呈顯著相關(guān)，說(shuō)明 糙米在微量吸水活性化過(guò)程中，大分子物質(zhì)逐漸分解成小分子物質(zhì)，以供糙米籽粒生命活動(dòng)，在此過(guò)程中芽體萌動(dòng)，酶源被激活，其中GABA由Glu在GAD的作用下脫羧形成，相關(guān)性分析 表明它們含量為正相關(guān)關(guān)系。這是因?yàn)椴诿谆钚曰^(guò)程中蛋白酶被激活，氨基酸代謝加強(qiáng)，而Glu為氨基酸代謝中樞紐[21]，在其被GAD催化脫羧的同時(shí)，也被大量生成。還原糖和淀粉含量之間無(wú)顯著相關(guān)性，可能原因 是糙米微量吸水活性化過(guò)程僅為芽體萌動(dòng)的過(guò)程，物質(zhì)消耗并不明顯；此外，在活性化過(guò)程中淀粉亦可分解為α-界限糊精等物質(zhì)[22]，由于活性化時(shí)間較短，未能完全將淀粉酶活性激活，因而未能將其分解為還原性糖。

表5 糙米活性化過(guò)程中主要物質(zhì)含量之間的相關(guān)性Table5 Correlation analysis of biochemical indicators in activated brown rice under the optimum condition of culture solution

3 結(jié) 論

糙米采用濕潤(rùn)吸水的活性化過(guò)程中富集GABA的最優(yōu)霧化液pH 3.5、VB6濃度2 mmol/L、CaCl2濃度10 mmol/L；在此條件下，活性化糙米中GABA含量可達(dá)7.67 mg/100 g，為原料糙米的2.74 倍；隨著活性化時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米中游離氨基酸、還原糖含量和GAD活力呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，可溶性蛋白及淀粉含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，部分大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，以供糙米生命活動(dòng)之需。

[1] WATCHARARPARPAIBOON W LAOHAKUNJIT N KERDCHOECHUEN O et al An improved process for high quality and nutrition of brown rice production[J]. Food Science and Technology International′2010′16(2): 147-158.

[2] LAMBERTS L de BIE E VANDEPUTTE G E et al Effect of milling on colour and nutritional properties of rice[J]. Food Chemistry′2007′100(4): 1496-1503.

[3] PATIL S B KHAN M K Germinated brown rice as a value added rice product a review[J]. Journal of Food Science and Technology′2011′48(6): 661-667.

[4] DEE WATTHANAWONG R ROWELL P WATKINS C B et al. γ-Aminobutyric acid (GABA metabolism in CO2treated tomatoes[J]. Postharvest Biology and Technology′2010′5 7(2): 97-105.

[5] IVERSEN L GABA pH armacology-what prospects for the future[J]. Biochemical Pharmacology′2004′68(8): 1537-1540.

[6] TSUKATANI T MATSUMOTO K Sequential fl uorometric quantification of γ-aminobutyrate and l-glutamate using a single line flow-injection system with immobilized enzyme reactors[J]. Analytica Chimica Acta′2005′546(2): 154-160.

[7] OBATA K HIRONO M KUME N et al GABA and synaptic inhibition of mouse cerebellum lacking glutamate decarboxylase 67[J]. Biochemical and Biophysical Research C ommunications′2008′370(3): 429-433.

[8] 韓永斌′顧振新′蔣振暉. Ca2+浸泡處理對(duì)發(fā)芽糙米生理指標(biāo)和GABA等物質(zhì)含量的影響[J]. 食品科學(xué)′2006′27(10): 58-61.

[9] SHELP B J BOWN A W MCLEAN M D et al Metabolism and functions of gamma-am inobutyric acid[J]. Trends in Plant Science′1999′4(11): 446-452.

[10] 蔣振暉′顧振新. 高等植物體內(nèi)γ-氨基丁酸合成′代謝及其生理作用[J]. 植物生理學(xué)通訊 ′2003′39(3): 249-254.

[11] 王京廈. 發(fā)芽糙米工藝研究[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)′2006.

[12] 蔣晨虹′顧穎娟′薛梅′等. 一種發(fā)芽糙米白米的制備方法: 中國(guó)′201110383546.6[P]. 2012-06-13.

[13] 衛(wèi)生 部. GB/T 5009.9—2008 食品中淀粉的測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社′2008.

[14] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社′2000: 182-197.

[15 ] YANG Runqiang GUO Qianghui GU Zhenxin et al GABA shunt and polyamine degradation pathway on γ-aminobutyric acid accumulation in germinating fava bean under hypoxia[J]. Food Chemistry′2013′136(1): 152-159.

[16] BAI Qingyun CHAI Me iqing GU Zhenxin et al Effects of components in culture medium on glutamate dec arboxylase activity and γ-aminobutyric acid accumulation in foxtail millet during germination[J]. Food Chemistry′2009′116(1): 152-157.

[17] GUO Yingjuan YANG Runqiang CHEN Hui et al Accumulation of γ-aminobutyri c acid in germinated soybean (Glycine max L.) in relation to glutamate decarboxylase and diamine oxidase activity induced by additives under hypoxia[J]. European Food Research and Technology′2012′234(4): 679-687.

[18] 陳惠. 發(fā)芽蠶豆γ-氨基丁酸富集與調(diào)控技術(shù)研究[D ]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)′2012.

[19] TOKUNAGA M NAKANO Y KITAOKA S et al The GABA shunt in the callus cells derived from soybean cotyledon[J]. Agricultural and Biological Chemistry′1976′40(1): 115-120.

[20] 孫向東. 發(fā)芽糙米研究最新進(jìn)展[J]. 中國(guó)稻米′2005(3): 5-8.

[21] 楊志敏. 生物化學(xué)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社′2010: 325-327.

[22] 蔣振暉. Ca2+和通氣處理對(duì)糙米發(fā)芽過(guò)程中主要物質(zhì)變化的影響及γ-氨基丁酸富集技術(shù)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)′2003.

Optimization of Atomized Liquid Components for γ-Aminobutyric Acid Accumulation in Activated Brown Rice

GENG Chengxin YANG Runqiang GU Zhenxin*
(College of Food Science and Technology Nanjing Agricultural University Nanjing 210095′China)

The VB6and CaCl2concentration and pH of citric acid atomized liquid for γ-aminobutyric acid (GABA accumulation in activated brown rice were optimized by single-factor and orthogonal array experiments Besides the changes in glutamate decarboxylase (GAD activity and main component conten ts of activated brown rice were studied Results showed that the optimum atomized liquid contained 2 mmol/L VB6and 10 mmol/L CaCl2at pH 3.5. Under these conditions GABA content of activated brown rice reached 7.67 mg/100 g which was a 2.74-fold increase over that of raw brown rice During the activation process the contents of free amino acids reducing sugar and GAD activity were all increased while the contents of both soluble protein and starch were decreased Correlation analysis showed that the content of GABA was significantly correlated with the contents of Glu free amino acids and soluble protein respectively.

activated brown rice; γ-aminobutyric acid pH VB6; CaCl2

TS255.1

A

1002-6630（2015）06-0035-05

10.7506/spkx1002-6630-201506007

2014-08-02

糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201313011-4）

耿程欣（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称分泄δ艹煞值母患夹g(shù)。E-mail：2012108018@njau.edu.cn

*通信作者：顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與功能食品。E-mail：guzx@njau.edu.cn