陳安徽，邵 穎，李繼武，蔣昭志，陳宏偉

（1.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008；2.亳州千草藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800）

人工培育蟬花蟲(chóng)草的抗腫瘤活性

陳安徽1，邵 穎1，李繼武2，蔣昭志2，陳宏偉1

（1.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008；2.亳州千草藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800）

以天然蟬花蟲(chóng)草生藥為對(duì)照，以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢腫瘤（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞株為模型，采用刃天青染色法檢測(cè)人工培育蟬花蟲(chóng)草的抗腫瘤活性。結(jié)果表明：人工培育蟬花蟲(chóng)草和天然蟬花蟲(chóng)草生藥都具有抗腫瘤活性，且活性成分均為中等極性化合物。對(duì)人工培育蟬花蟲(chóng)草中的抗腫瘤活性成分進(jìn)行分離制備，得到兩種化合物，命名為化合物1和化合物2?；衔?經(jīng)鑒定為蟲(chóng)草素，化合物2經(jīng)純度驗(yàn)證為純品，活性驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)其質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)CHO細(xì)胞抑制率高達(dá)（94.55±2.33）%。

人工培育蟬花蟲(chóng)草；抗腫瘤活性；CHO細(xì)胞；蟲(chóng)草素

蟬花（Cordyceps cicadae）又名蟬茸、蟬草等，是蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）等真菌寄生于一些蟬若蟲(chóng)后形成的菌蟲(chóng)復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材[1-4]。蟬花具有多種藥用價(jià)值，古代和現(xiàn)代醫(yī)書(shū)《證類本草》、《本草綱目》、《中華藥物大全》和《中華藥?！分芯陀涊d蟬花有主治小兒天吊、夜啼心悸、解痙、散風(fēng)熱，治療麻疹、多淚、目赤等功效[5]，近代滬上名醫(yī)陳以平教授還最早使用蟬花代替冬蟲(chóng)夏草治療慢性腎功能衰竭，并取得顯著成效[6]。但是近年來(lái)天然野生蟬花資源短缺，使得蟬花的人工培育及其人工培養(yǎng)物的功效價(jià)值受到了廣泛關(guān)注[7-11]。陳祝安等[12]于自然基物上對(duì)蟬擬青霉進(jìn)行人工培養(yǎng)獲得了類似蟲(chóng)體生的孢梗束，并發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)物具有明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解熱等作用，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)還表明人工培育蟬花還具有低毒的特性；徐紅娟等[13]對(duì)蟬擬青霉進(jìn)行液體深層發(fā)酵，并從發(fā)酵菌絲體中分離得到具有抗真菌活性的多球殼菌素；蟬花人工培養(yǎng)菌絲體經(jīng)系統(tǒng)翔實(shí)研究顯示其具有與天然蟬花相似的改善腎功能的功效[14-18]；許多學(xué)者對(duì)蟬擬青霉多糖進(jìn)行了系統(tǒng)研究，佐證了其明顯提高機(jī)體免疫力[19-22]、調(diào)節(jié)脂類代謝[23]、促進(jìn)造血、提升營(yíng)養(yǎng)狀況[24]的作用；陳柏坤等[25]曾提出蟬擬青霉多糖可能具有直接抑制白血病細(xì)胞株U937、K562的能力，但至今未見(jiàn)有關(guān)蟬花人工培養(yǎng)孢梗束及培養(yǎng)基質(zhì)抗腫瘤活性的研究。本研究以天然蟬花蟲(chóng)草生藥為對(duì)照，以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢腫瘤（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞株為模型，研究人工培育蟬花孢梗束及其培養(yǎng)基質(zhì)的抗腫瘤活性，并對(duì)人工培育蟬花孢梗束中的抗腫瘤活性成分進(jìn)行分離，以期為人工培育蟬花替代野生資源及人工培養(yǎng)物的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

天然蟬花蟲(chóng)草采集自安徽省蕭縣皇藏峪風(fēng)景區(qū)；無(wú)性型菌株保存于徐州工程學(xué)院食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（煮汁后4 層紗布過(guò)濾）、葡萄糖20 g、純水1 L，121 ℃滅菌20 min。

蟲(chóng)草栽培培養(yǎng)基：每只栽培瓶中裝小麥粒30 g、蟬幼蟲(chóng)干粉5 g、純水50 mL，121 ℃滅菌30 min。

細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM/F12液體培養(yǎng)基（含10%小牛血清以及100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)草栽培及樣品制備

蟬擬青霉固體斜面種子接入滅菌后冷卻至室溫的三角瓶種子培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶裝液量為100 mL、接種量為10%），置入25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d備用。蟲(chóng)草栽培采用圓柱形培養(yǎng)瓶（直徑15 cm、高18 cm）進(jìn)行，固體物料混勻后按照比例加水，浸泡2 h后進(jìn)行高溫滅菌（121 ℃，30 min），滅菌結(jié)束后冷卻至室溫，將制備好的液體種子按照每瓶10 mL的接種量接入固體培養(yǎng)基表面。接種后的栽培瓶放入20 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)箱溫度調(diào)整為25 ℃、光照時(shí)間為12 h/d，待培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生大量孢梗束，并且孢梗束頂部產(chǎn)生大量孢子時(shí)即可采收蟲(chóng)草部分及收集基質(zhì)（蟲(chóng)草采集后剩下的培養(yǎng)基部分）備用。

干燥后的蟬花蟲(chóng)草孢梗束及基質(zhì)（粉碎后過(guò)10 目篩）分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，甲醇進(jìn)行提取，提取條件：料液比為1∶10（m/V），超聲波（功率300 W，頻率20 kHz）浸提40 min后過(guò)濾收集濾液，各提取相脫除溶劑后采用12.5%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液配成100 μg/mL的樣品溶液，采用0.15 μm孔徑的一次性除菌過(guò)濾器過(guò)濾后備用。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)：將進(jìn)入對(duì)數(shù)分裂期的CHO細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到96 孔板中培養(yǎng)，以4.0×104個(gè)/孔接種，每孔接種量100 μL，接種后的酶標(biāo)板置于CO2培養(yǎng)箱（CO2體積分?jǐn)?shù)為5%）中37 ℃培養(yǎng)24 h，同時(shí)留出3 個(gè)空白孔（不加細(xì)胞）。待細(xì)胞貼壁后，用移液器移出培養(yǎng)液，然后逐孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL樣品溶液，同時(shí)設(shè)置100%陽(yáng)性對(duì)照組、0%空白對(duì)照組，100%和0%對(duì)照孔中分別加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL 12.5% DMSO（其中100%陽(yáng)性對(duì)照組是3 個(gè)無(wú)細(xì)胞的空白孔），每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，置入5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)72 h后，每孔加20 μL 0.05%刃天青，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)530 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。按下式計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。

式中：FLU100%為陽(yáng)性對(duì)照組熒光強(qiáng)度；FLU0%為溶劑空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 抗腫瘤成分的分離純化和制備

將人工培育蟬花蟲(chóng)草的乙酸乙酯提取物配成30 mg/mL的甲醇溶液，用0.22 μm孔徑的濾膜過(guò)濾后，直接進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析。色譜條件為：色譜柱依利特Hypersil ODS2；進(jìn)樣量50 μL；洗脫速率3mL/min；流動(dòng)相0～5 min 100%水，5～20 min 30%乙腈，20～40 min 60%乙腈，40～50 min 100%乙腈，50～60 min 100%水；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。采用樣品管按峰收集洗脫相，先在減壓環(huán)境下蒸發(fā)掉甲醇，然后真空冷凍干燥。干燥后每管加20 μL 12.5%的DMSO溶解后，取10 μL按照1.2.2節(jié)方法進(jìn)行活性測(cè)定，確定活性物質(zhì)的出峰時(shí)間，然后多次進(jìn)樣后收集活性物質(zhì)色譜峰中間位置的洗脫相。

1.2.4 活性物質(zhì)的純度及活性驗(yàn)證

利用薄層層析法和HPLC法進(jìn)行純度鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花蟲(chóng)草的抗腫瘤活性

表1 蟬花蟲(chóng)草及基質(zhì)不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)CHO細(xì)胞的毒性Table 1 Cytotoxicity of different organic solvent extracts from fruiting bodiess ooff Cordyceps cicaaddaaee and the compost

由表1可知，人工培育蟬花蟲(chóng)草和野生天然蟬花生藥均具有一定的抗腫瘤活性，并且兩樣品的抗腫瘤成分主要存在于乙酸乙酯提取相和甲醇提取相中，這說(shuō)明蟬花蟲(chóng)草中抗腫瘤活性物質(zhì)主要是中等極性偏強(qiáng)的成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同有機(jī)溶劑提取相抗腫瘤活性差異非常顯著，如人工培育蟬花蟲(chóng)草乙酸乙酯提取相的抗腫瘤活性極顯著高于石油醚相（P＜0.01），其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到78.35%，是石油醚相的4.9 倍。另外，發(fā)現(xiàn)人工培育蟬花蟲(chóng)草和基質(zhì)的不同溶劑提取相均具有一定抗腫瘤活性，其最強(qiáng)活性成分均存在于乙酸乙酯提取相中，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，人工培育蟬花蟲(chóng)草和基質(zhì)的乙酸乙酯提取相對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，人工培育蟬花蟲(chóng)草、基質(zhì)、天然蟬花蟲(chóng)草生藥均有一定的抗腫瘤活性，為抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供了新藥源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工培育蟬花蟲(chóng)草及基質(zhì)的甲醇相亦具有很強(qiáng)的抑制腫瘤活性，但是物質(zhì)的極性相對(duì)較強(qiáng)，不利于后期的分離純化，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)樣品乙酸乙酯提取相中抗腫瘤活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

2.2 蟬花蟲(chóng)草抗腫瘤活性成分的分離制備結(jié)果

圖1 人工培育蟬花蟲(chóng)草（a）和基質(zhì)（b）乙酸乙酯提取相的HPLC圖Fig.1 Chromatograms of ethyl acetate extracts from cultured fruiting bodies of Cordyceps cicadae (a) and the compost (b)

由圖1可知，人工培育蟬花蟲(chóng)草和基質(zhì)乙酸乙酯提取相中成分均較多，并且兩圖色譜峰并不完全一致，但是有些成分的保留時(shí)間幾乎完全一致，如在8.8、11、16、24、30 min等多處保留時(shí)間均有洗脫主峰出現(xiàn)。

表2 不同HPLC餾分的抗腫瘤活性Table 2 Cytotoxicity assay of HPLC eluates

由表2可知，人工培育蟬花蟲(chóng)草和基質(zhì)乙酸乙酯提取相中多個(gè)成分均具有一定抗腫瘤活性，其中蟲(chóng)草乙酸乙酯提取相的抗腫瘤活性成分色譜峰保留時(shí)間主要是23.998 min和39.888 min；基質(zhì)乙酸乙酯提取相抗腫瘤活性成分色譜峰保留時(shí)間主要是24.128 min和39.814 min，即兩種提取物中抗腫瘤活性成分的保留時(shí)間幾乎一致，為進(jìn)一步驗(yàn)證兩樣品中24 min處的洗脫物是否為同種成分，進(jìn)行薄層層析，發(fā)現(xiàn)兩樣品在薄層板上Rf值完全一致，混合后記為樣品1進(jìn)行點(diǎn)樣，在薄層板上均出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)，初步判定兩樣品為同一種成分。進(jìn)一步驗(yàn)證40 min左右處的兩樣品洗脫相，合并記為樣品2，分析發(fā)現(xiàn)兩洗脫組分亦為同種成分，出現(xiàn)這種情況的可能原因是基質(zhì)樣品中的培養(yǎng)基成分幾乎已被消耗殆盡，其中主要是蟬擬青霉菌絲體，可能菌絲體代謝物中抗腫瘤活性主要成分和子實(shí)體中的主要抗腫瘤活性成分是一致的。下一步實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)人工培育蟬花蟲(chóng)草乙酸乙酯提取相中抗腫瘤活性成分進(jìn)行分離。

圖2 樣品1（a）和樣品2（b）的HPLC圖Fig.2 Chromatograms of sample 1 (a) and sample 2 (b)

將人工培育蟬花蟲(chóng)草乙酸乙酯提取相按照1.2.3節(jié)所述方法采用HPLC進(jìn)行制備，主要收集23.998 min和39.888 min處的洗脫液，為保證樣品純度，主要收集色譜峰中間處的洗脫液，多次收集合并后備用。如圖2所示，將保留時(shí)間在30、40 min左右的化合物分別命名為化合物1和化合物2。經(jīng)與蟲(chóng)草產(chǎn)品中常見(jiàn)化合物標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，發(fā)現(xiàn)化合物1的HPLC峰和薄層色譜（thin layer chromatogram，TLC）圖中Rf值都與蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。另外，化合物1的紫外光譜具有典型的核苷類260 nm波長(zhǎng)處特征峰，因此可確定化合物1的成分為蟲(chóng)草素。蟲(chóng)草素是已知的對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，但其活性較低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致?；衔?與蟲(chóng)草產(chǎn)品中常見(jiàn)化合物標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)色譜條件完全一致的成分，初步判定此化合物可能為一種新的化合物或一種已知但不常見(jiàn)的化合物。

2.3 制備樣品純度及活性驗(yàn)證結(jié)果

將制備得到的化合物2經(jīng)HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純度驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 化合物2的純度驗(yàn)證HPLC圖Fig.3 Chromatogram of compound 2

由圖3可知，采用不同流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，色譜圖中均只有一個(gè)主峰出現(xiàn)，可初步判定該化合物為純品。進(jìn)一步采用TLC（展開(kāi)劑為乙酸乙酯-甲醇（8∶2，V/V））對(duì)化合物2進(jìn)行純度分析，結(jié)果如圖4所示，薄層板上采用不同顯色劑顯示，均出現(xiàn)一個(gè)樣品斑點(diǎn)，由此可初步判定該化合物為純品。

圖4 化合物2的TLC圖Fig.4 TLC chromatogram of compound 2

對(duì)收集到的化合物2，脫除溶劑后真空冷凍干燥。干燥樣品以12.5% DMSO溶解稀釋，使樣品質(zhì)量濃度為500 μg/mL（檢測(cè)終質(zhì)量濃度50 μg/mL），樣品經(jīng)0.15 μm孔徑一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌，進(jìn)行活性驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物2在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率達(dá)到（94.55±2.33）%。

3 討 論

蟬花蟲(chóng)草為一種傳統(tǒng)的滋補(bǔ)佳品，在我國(guó)有悠久的應(yīng)用歷史。近年來(lái)，隨著蟬花蟲(chóng)草應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，天然蟬花蟲(chóng)草生藥已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)需求，人工培育的蟬花蟲(chóng)草已逐步替代天然蟬花蟲(chóng)草生藥解決了藥源緊缺的問(wèn)題。目前對(duì)人工培育蟬花蟲(chóng)草的研究報(bào)道相對(duì)較少，尤其是對(duì)人工培育蟬花蟲(chóng)草抗腫瘤活性的系統(tǒng)研究更是未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)人工培育蟬花蟲(chóng)草及天然蟬花蟲(chóng)草生藥均具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，并且人工培育蟬花蟲(chóng)草采收后的基質(zhì)也具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，這說(shuō)明單純從抗腫瘤活性來(lái)說(shuō)，可以將人工培育蟬花蟲(chóng)草和培養(yǎng)基質(zhì)共同使用，不需要單獨(dú)分開(kāi)采收。實(shí)驗(yàn)對(duì)蟬花蟲(chóng)草中抗腫瘤活性成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人工培育蟬花蟲(chóng)草和基質(zhì)中主要抗腫瘤活性成分為同種化合物。對(duì)樣品中的抗腫瘤成分分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，人工培育蟬花蟲(chóng)草抗腫瘤成分主要為兩種，其中一種為蟲(chóng)草素，另一種化合物在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率達(dá)到（94.55±2.33）%。該研究不僅充分證明蟬花蟲(chóng)草可以作為抗腫瘤藥物或保健品的較佳原料，同時(shí)也為蟬花蟲(chóng)草資源的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

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Antitumor Activity of Cultured Fruiting Bodies of Cordyceps cicadae

CHEN Anhui1， SHAO Ying1， LI Jiwu2， JIANG Zhaozhi2， CHEN Hongwei1
(1. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe， Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008， China; 2. Bozhou Qiancao Pharmaceutical Co. Ltd.， Bozhou 236800， China)

The antitumor activity of the cultured fruiting bodies of Cordyceps cicadae on Chinese hamster ovary (CHO) cells was investigated by measuring cell viability using a resazurin reduction assay in comparison with that of wild Cordyceps cicadae. The experimental results showed that both samples had antitumor activity and contained mid-polar compounds. Two bioactive compounds, namely components 1 and 2, were separated from the cultured fruiting bodies of Cordyceps cicadae. Component 1 was identifi ed as cordycepin. Component 2 (50 μg/mL) was identifi ed as a purifi ed compound that could inhibit the viability of CHO cells by up to (94.55±2.33)%.

cultivated Cordyceps cicadae; antitumor activity; Chinese hamster ovary (CHO) cells; cordycepin

Q939

A

1002-6630（2015）09-0194-04

10.7506/spkx1002-6630-201509036

2014-06-30

安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目（1301C063011）

陳安徽（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：chenah201@163.com