宋家樂，李貴節(jié)，趙 欣，*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，食品衛(wèi)生與營養(yǎng)學(xué)教研室，廣西 桂林 541004；2.重慶第二師范學(xué)院，功能性生態(tài)食品研究所，重慶 400067；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

竹鹽釀造醬油對H2O2誘發(fā)LLC-PK1細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

宋家樂1，2，李貴節(jié)2，3，趙 欣2，3，*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，食品衛(wèi)生與營養(yǎng)學(xué)教研室，廣西 桂林 541004；2.重慶第二師范學(xué)院，功能性生態(tài)食品研究所，重慶 400067；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

目的：研究竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2誘發(fā)豬腎近曲上皮小管細(xì)胞（pig proximal tubular cell）LLC-PK1氧化損傷的保護(hù)作用。方法：以不同質(zhì)量濃度（10～200 μg/mL）的竹鹽釀造醬油乙醇提取物預(yù)培養(yǎng)LLC-PK1細(xì)胞24 h后，換用含500 μmol/L H2O2的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h建立細(xì)胞氧化損傷模型。四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細(xì)胞生存率，硫代巴比妥酸比色法測定細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，比色法測定細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。結(jié)果：經(jīng)不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物預(yù)處理24 h后，受損細(xì)胞的生存率上升，細(xì)胞內(nèi)MDA生成量減少，ROS水平顯著降低。同時，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）的活性及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平，GSH含量也較未經(jīng)竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理的受損細(xì)胞增加。結(jié)論：竹鹽釀造醬油乙醇提取物可以通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的活性和抗氧化物質(zhì)GSH的含量而有效地對抗H2O2誘發(fā)的LLC-PK1細(xì)胞氧化損傷。

竹鹽釀造醬油；氧化損傷；抗氧化；LLC-PK1細(xì)胞

自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），例如超氧陰離子（O2—）、過氧根離子（O22—）、羥自由基（?OH）、過氧化氫（H2O2）和過氧亞硝酸根（ONOO—）是生物體在進(jìn)行有氧呼吸時所產(chǎn)生的一類代謝副產(chǎn)物。體內(nèi)蓄積過多的ROS能引起細(xì)胞或組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，特別是其誘發(fā)的腎臟上皮細(xì)胞氧化損傷，被認(rèn)為是導(dǎo)致腎臟疾患的重要致病因素之一[1]。特別值得注意的是，在諸多ROS中，H2O2能夠較容易地穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，誘發(fā)細(xì)胞膜內(nèi)多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而引起腎臟細(xì)胞損傷，最后導(dǎo)致整個腎臟組織壞死[1-3]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)部存在內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，包含過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）以及非酶性的谷胱甘肽（glutathione，GSH）。內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)能幫助清除體內(nèi)過多的自由基和活性氧，以此緩解氧化應(yīng)激所造成的損傷。此外，攝取含有豐富抗氧化物質(zhì)的食品也有助于提升機(jī)體自身的抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激對腎臟機(jī)能所造成的不良影響[4-5]。

醬油是以大豆為主要原材料，加入水、豆粕、淀粉、小麥和食鹽等輔料經(jīng)過制曲、微生物發(fā)酵等過程而制成的一種營養(yǎng)豐富且廣受亞洲特別是東亞地區(qū)人群所喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品。醬油中富含多種人體需要的營養(yǎng)成分如糖類、必需氨基酸、脂肪酸、維生素、煙酸以及鈣、磷等礦物質(zhì)元素。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，醬油也是一種具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、降血壓等功效的保健食品[6-9]。本實驗利用體外培養(yǎng)LLC-PK1豬腎近曲小管上皮細(xì)胞建立H2O2誘導(dǎo)的LLC-PK1上皮細(xì)胞氧化損傷模型，探究竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2所誘發(fā)的豬腎臟上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為竹鹽釀造醬油在氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的腎臟疾病的保健預(yù)防功能研究方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、材料與試劑

LLC-PK1豬腎近曲上皮小管細(xì)胞購自美國典型微生物菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

竹鹽釀造醬油系韓國仁山家竹鹽公司產(chǎn)品。取適量冷凍干燥后的醬油樣品，按1∶10（V/V）比例加入80%乙醇溶液，室溫攪拌提取2～3 h后過濾，重復(fù)該過程3 次，合并濾液。濾液經(jīng)3 600 r/min離心15 min后收集上清液，經(jīng)50 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制備得到醬油乙醇提取物并用二甲基亞砜配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的儲備液，—20 ℃貯存待用。

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2’，7’-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Invitrogen公司；SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒、GSH-Px測定試劑盒、GSH測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會社；Thermo 3110二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Combi-514R冷凍離心機(jī) 韓國Hanil株式會社；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀、Bio-Rad小型水平電泳槽美國Bio-Rad公司；ABI 2720 PCR儀 美國Applied Biosystems公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀 德國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

LLC-PK1細(xì)胞以含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液放置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)，每2～3 d換液。分組時細(xì)胞按1×104、2×105個/孔分別接種于96 孔和6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待貼壁后，用含H2O2（500 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，制備氧化損傷細(xì)胞模型。LLC-PK1氧化損傷模型細(xì)胞分別按1×104個/孔，每孔100 μL接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，以不同質(zhì)量濃度（10、50、100 μg/mL）的竹鹽釀造醬油乙醇提取物（extract from bamboo salt sauce，BSSE）培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實驗測定。未經(jīng)過任何處理的正常LLC-PK1細(xì)胞作為正常組。

1.3.2 MTT法測定細(xì)胞存活率

LLC-PK1細(xì)胞按照1.3.1節(jié)方法處理后，棄孔內(nèi)培基并加入100 μL MTT溶液（終質(zhì)量濃度 0.5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加100 μL二甲基亞砜避光振蕩30 min，測定OD490nm后按公式（1）計算細(xì)胞生存率。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)MDA生成量的測定

細(xì)胞接種于6 孔板，依1.3.1節(jié)方法處理后，硫代巴比妥酸比色法測定細(xì)胞內(nèi)MDA生成量[10]。在5 mL玻璃試管中加入500 μL細(xì)胞裂解上清液、400 μL 15%的三氯乙酸與0.67%硫代巴比妥酸混合溶液（內(nèi)含0.01% 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚），充分混勻并在95 ℃水浴中保溫20 min。待冷卻后，加入3 mL的異丙醇提取色素并測定OD532nm，細(xì)胞總蛋白含量以Bio-Rad蛋白質(zhì)試劑盒定量。按照公式（2）計算MDA生成量。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的測定

在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按一定濃度接種細(xì)胞并依1.3.1節(jié)方法處理，加入含DCFH-DA（20 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液37 ℃孵育20 min，隨后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，用FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm，按照公式（3）計算相對ROS含量。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力和GSH含量的測定

細(xì)胞按2×105個/孔接種于6 孔板，依1.3.1節(jié)所述方法處理后，取適量細(xì)胞培養(yǎng)上清液按SOD、CAT、GSH-Px和GSH各自的測定試劑盒說明書步驟操作，酶活力以酶比活力單位（U/mg pro）表示，并用細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量作校正。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

LLC-PK1細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，依1.3.1節(jié)所述方法處理后，使用Trizol試劑照說明書提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，紫外法檢測純度后，將各樣品組的總RNA濃度調(diào)整至同一水準(zhǔn)。各組取等量RNA（2 μg）分別加入OligodT18、RNase、dNTP和MLV酶各1 μL，5×Buffer 10 μL，在20 μL體系下，37 ℃ 120 min，99 ℃ 4 min，4 ℃ 3 min條件下合成cDNA?；蛐蛄心孓D(zhuǎn)錄后，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35 次，72 ℃延伸10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測最終產(chǎn)物的表達(dá)程度，并用Image J軟件分析基因表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法觀察10、50、100 μg/mL竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1豬腎近曲小管上皮細(xì)胞的毒性效應(yīng)時，3 種質(zhì)量濃度處理下的細(xì)胞生存率均超過80%（結(jié)果未顯示），該結(jié)果提示竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。因此10～100 μg/mL為對細(xì)胞無影響的安全質(zhì)量濃度，并用于后續(xù)研究。如圖1所示，與正常組細(xì)胞比較，未經(jīng)竹鹽釀造醬油乙醇提取物預(yù)處理的細(xì)胞在暴露于H2O2（500 μmol/L）4 h后，生存率明顯下降（P＜0.05）。相反，經(jīng)不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10～100 μg/mL）預(yù)處理24 h后，受損細(xì)胞的生存率較損傷模型組（0 μg/mL）細(xì)胞明顯增加，且保護(hù)效果隨竹鹽釀造醬油乙醇提取物的質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。該結(jié)果提示竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10～100 μg/mL）可有效地抑制氧化應(yīng)激損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。

圖1 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1豬腎近曲小管細(xì)胞的保護(hù)效果Fig.1 Protective effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on LLC-PK1 renal proximal tubule cells

2.2 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)MDA生成量的影響

圖2 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2致?lián)pLLC-PK1細(xì)胞內(nèi)MMDDAA含量的影響Fig.2 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of MDA in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

自由基和ROS所誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而生成對細(xì)胞具有毒性作用的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，因此MDA可作為衡量氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成損傷的指標(biāo)物質(zhì)[11]。如圖2所示，經(jīng)500 μmol/L的H2O2處理后，LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)MDA的生成量明顯上升（P＜0.05），在同時給予不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）處理后，細(xì)胞內(nèi)MDA生成量呈明顯下降趨勢，且在最高質(zhì)量濃度100 μg/mL時，呈現(xiàn)出最強(qiáng)的MDA生成抑制能力，這是由于醬油中含有豐富的大豆異黃酮和類黑素等具有強(qiáng)抗氧化能力的活性物質(zhì)[12-13]，而給予抗氧化劑可以降低H2O2引起腎臟細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度，防止腎臟細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷[14]。本結(jié)果提示竹鹽釀造醬油乙醇提取物能有效地通過降低氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞內(nèi)MDA的生成量而保護(hù)細(xì)胞。

2.3 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響

機(jī)體內(nèi)部過量生成ROS可造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[15-16]。作為一種重要的ROS，H2O2能較為容易地通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+通過Fenton反應(yīng)生成具有高度活性的?OH，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)諸如DNA、蛋白質(zhì)和脂類的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。如圖3所示，H2O2顯著地提高了受損細(xì)胞內(nèi)ROS水平，加速細(xì)胞氧化損傷的進(jìn)程。相反，經(jīng)24 h不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）預(yù)處理后，受損細(xì)胞內(nèi)的ROS水平逐漸降低，且與損傷模型組（0 μg/mL）相比有明顯差異（P＜0.05）。該結(jié)果提示竹鹽釀造醬油是一種良好的ROS清除劑。

圖3 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2致?lián)pLLC-PK1細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響Fig.3 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of ROS in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

2.4 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對受損LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD、GSH-Px活力的影響

表1 竹鹽釀造醬油對H2O2致?lián)pLLC-PK1細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px活力的影響Table 1 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the levels of CAT， SOD and GSH-Px in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)如抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）以及非酶性的GSH能有效地對抗氧化應(yīng)激損傷對機(jī)體造成的傷害。SOD可以將細(xì)胞內(nèi)多余的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，且生成的H2O2可以被CAT和GSH-Px轉(zhuǎn)化為無害的水[18]。如表1所示，H2O2能顯著降低細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活力，加速細(xì)胞的氧化損傷。相反，經(jīng)24 h不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）預(yù)處理后，受損細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶的活力逐漸升高，與損傷模型組（0 μg/mL）比較有明顯差異（P＜0.05）。此外，添加CAT和SOD有助于防止氧化應(yīng)激對LLC-PK1細(xì)胞所造成的損傷，同時還可以抑制氧化應(yīng)激所造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[19-20]。

2.5 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響

GSH作為機(jī)體內(nèi)的一種主要的非酶性抗氧化劑，不僅可以直接通過GSH-Px還原毒性的脂質(zhì)過氧化物和H2O2，還可以間接地抑制體內(nèi)自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，避免細(xì)胞因自由基所導(dǎo)致的損傷[17-18]。如圖5所示，H2O2明顯降低細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，而經(jīng)不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物（10、50、100 μg/mL）預(yù)處理24 h后，受損細(xì)胞內(nèi)GSH的含量逐漸增高，且與損傷模型組（0 μg/mL）比較存在明顯差異（P＜0.05）。

圖4 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對H2O2致?lián)pLLC-PK1細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響Fig.4 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the level of GSH in LLC-PK1 cells exposed to H2O2

2.6 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px基因表達(dá)水平的影響

圖5 竹鹽釀造醬油乙醇提取物對LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)CAT SOD和GSH Px基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of ethanol extract from bamboo salt soy sauce on the gene expressions of CAT， SOD and GSH-Px in LLC-PK1 cells

如圖5所示，竹鹽釀造醬油乙醇提取物可有效地增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px的基因在LLC-PK1細(xì)胞中的表達(dá)，從而增強(qiáng)對LLC-PK1細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。此外，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)CAT和GSH-Px的轉(zhuǎn)錄水平有助于提高細(xì)胞內(nèi)總銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）和錳過氧化物歧化酶（MnSOD）的活性，進(jìn)而有效地幫助細(xì)胞對抗活性氧造成的氧化應(yīng)激損傷[16，19-20]。

3 結(jié) 論

通過MTT法、硫代巴比妥酸比色法測定細(xì)胞內(nèi)抗氧化標(biāo)志物水平，采用RT-PCR法對竹鹽釀造醬油乙醇提取物保護(hù)H2O2誘發(fā)豬腎近曲小管上皮細(xì)胞LLC-PK1發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，LLC-PK1細(xì)胞暴露于H2O2（500 μmol/L）后，細(xì)胞生存率及胞內(nèi)主要抗氧化酶活力明顯下降，ROS水平及MDA含量明顯上升；預(yù)先給予不同質(zhì)量濃度的竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理24 h后，LLC-PK1細(xì)胞生存率較未經(jīng)竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理的受損細(xì)胞明顯增高（P＜0.05）。作為細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷后的一種主要生物標(biāo)志物，MDA是ROS攻擊細(xì)胞生物膜內(nèi)多不飽和脂肪酸后所形成的脂質(zhì)過氧化物，檢測其生成量可間接反映細(xì)胞的受損程度。經(jīng)不同質(zhì)量濃度竹鹽釀造醬油乙醇提取物預(yù)先保護(hù)24 h后，受損細(xì)胞內(nèi)的ROS及MDA含量較未經(jīng)竹鹽釀造醬油乙醇提取物處理的受損細(xì)胞明顯降低。同時，受損細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）活力及非酶性抗氧化物質(zhì)GSH的含量也得到顯著提升。此外，竹鹽釀造醬油還能上調(diào)受損細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化酶的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。本實驗為竹鹽釀造醬油作為保健食品緩解自由基引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷提供了一定的理論依據(jù)，但本實驗結(jié)果僅限于細(xì)胞水平的體外實驗，對竹鹽釀造醬油在氧化應(yīng)激損傷下對細(xì)胞保護(hù)的具體分子生物學(xué)機(jī)制及其在體內(nèi)的抗氧化保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

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Protective Effect of Bamboo Salt Soy Sauce on H2O2-Induced Cellular Oxidative Damage in LLC-PK1 Cells

SONG Jiale1，2， LI Guijie2，3， ZHAO Xin2，3，*
(1. Department of Food Hygiene and Nutrition， School of Public Health， Guilin Medical University， Guilin 541004， China; 2. Institute of Functional Ecological Food， Chongqing University of Education， Chongqing 400067， China; 3. Department of Biological and Chemical Engineering， Chongqing University of Education， Chongqing 400067， China)

The aim of this study was to investigate the protective effect of ethanol extract from bamboo salt sauce (BSSE) on H2O2-induced oxidative damage in porcine renal epithelial (LLC-PK1) cells. The LLC-PK1 cells were first incubated with different concentrations of BSSE (10-200 μg/mL) for 24 h， and then exposed to H2O2(500 μmol/L) for 4 h. MTT assay was used to evaluate the cell viability. The cellular levels of reactive oxygen species (ROS)， lipid peroxidation， and antioxidant enzymes including catalase (CAT)， superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GSH-Px) and glutathione (GSH) were measured. In addition， mRNA levels of these antioxidant enzymes were determined by RT-PCR assay. BSSE was able to increase the cell viability， and also decrease the cellular levels of ROS， lipid peroxidation， as well as increase the activity and mRNA expression of antioxidant enzymes when compared with those in control cells. These results suggest that BSSE showed a protective effect against H2O2-induced oxidative damage in LLC-PK1 cells through inhibiting lipid peroxidation，deceasing ROS levels， and increasing antioxidant system activities.

bamboo salt soy sauce; oxidative damage; antioxidant; LLC-PK1 cells

TS201.4

A

1002-6630（2015）09-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201509032

2014-06-24

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)計劃資助項目（KJTD201325）

宋家樂（1983—），男，講師，博士，研究方向為分子營養(yǎng)學(xué)和植物化學(xué)。E-mail：biopaul@pusan.ac.kr

*通信作者：趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)學(xué)和食品化學(xué)。E-mail：foods@live.cn