孫 杰,胡 奇,李世芬,鐘義紅,環(huán) 飛,王玉邦
(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心,江蘇 南京 210029)
番茄紅素的安全性評(píng)價(jià)及對(duì)小鼠免疫功能的影響
孫 杰,胡 奇,李世芬,鐘義紅,環(huán) 飛,王玉邦*
(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心,江蘇 南京 210029)
目的:研究番茄紅素的食品安全性及對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法:進(jìn)行大鼠30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn),小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn),測(cè)定小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性。結(jié)果:雌、雄小鼠的番茄紅素急性經(jīng)口毒性>2 666.64 mg/kg,屬實(shí)際無(wú)毒級(jí);番茄紅素200、433.33、666.67 mg/(kg?d)劑量(以體質(zhì)量計(jì),下同)在30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)大鼠的血液常規(guī)和血清生化指標(biāo)產(chǎn)生影響,且Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性;以33.33、66.67、200 mg/(kg?d)3 個(gè)劑量進(jìn)行小鼠免疫功能實(shí)驗(yàn),200 mg/(kg?d)劑量組的雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)、自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞活性高于陰性對(duì)照組,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:番茄紅素食品安全性良好,高劑量番茄紅素作為食品添加劑在小型嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有增強(qiáng)免疫力的功能。
番茄紅素;免疫功能;食品安全
氧化應(yīng)激損傷是指機(jī)體在遭受有害刺激時(shí),體內(nèi)活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生過(guò)多,或清除氧化自由基的酶系統(tǒng)功能減弱而導(dǎo)致的組織損傷[1-3]。氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致人類皮膚衰老的重要因素,其對(duì)細(xì)胞組織造成傷害,可以導(dǎo)致機(jī)體功能蛻化,也是造成心腦血管疾病中神經(jīng)損傷的主要因素[4-5]。適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充抗氧化劑可以緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷,因此,天然抗氧化劑一直是冠心病[6-7]、高血脂、糖尿病[8-9]、神經(jīng)退行性病變等多種中老年慢性疾病預(yù)防藥物與美容行業(yè)的研究熱點(diǎn)。
類胡蘿卜素具有很好的抗氧化與抗自由基活性,番茄紅素(lycopene)屬于類胡蘿卜素類脂溶性色素,廣泛存在于番茄、西柚等水果中?,F(xiàn)代研究證實(shí),番茄紅素可以改善成纖維細(xì)胞中自由基清除酶活力,提高成纖維細(xì)胞對(duì)紫外損傷的抗氧化能力[10],對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)心腦血管內(nèi)皮產(chǎn)生的損傷,減輕動(dòng)脈粥樣硬化形成[11-12],通過(guò)增加Beclin1基因與LC3蛋白表達(dá)抑制心肌細(xì)胞肥大[13],對(duì)急性心肌梗死及高血糖所導(dǎo)致的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙具有保護(hù)作用[14-15]。番茄紅素體外實(shí)驗(yàn)證明其可以顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901以及MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468這3 種乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[16-17],并且對(duì)順鉑導(dǎo)致的大鼠急性肝腎損傷具有保護(hù)作用[18]。人體實(shí)驗(yàn)證明,中等劑量的番茄紅素膠囊可以提高人體的抗氧化能力,降低急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后人體血清脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)增高幅度并減少氧化酶的消耗[19-20]。此外,番茄紅素?cái)z入量不足的人群前列腺上皮內(nèi)瘤與前列腺癌發(fā)病率較高,適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充番茄紅素可以降低前列腺癌組織中血管增生等級(jí)[21-22]。番茄紅素正快速成為抗衰老、預(yù)防老年病心腦血管病變及神經(jīng)退行性病變的保健食品[23-24],作為類胡蘿卜素,關(guān)于番茄紅素的安全性研究罕見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)采用急性毒性實(shí)驗(yàn)、30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)等對(duì)番茄紅素的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),并采用國(guó)標(biāo)方法對(duì)番茄紅素增強(qiáng)小鼠免疫功能進(jìn)行研究,以期為番茄紅素的口服安全性及增強(qiáng)免疫活性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。
1.1 材料、動(dòng)物與試劑
番茄紅素由新疆瑞琦生物科技有限公司提供(純度≥5%,批號(hào):20120710),所得番茄紅素粉樣品編號(hào)為XH20120512A,按照GB 28316—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑 番茄紅》方法檢測(cè)番茄紅素含量為5.26%。
增強(qiáng)免疫力與30 d喂養(yǎng)研究分別選用SPF級(jí)BI/F1代健康雌性小鼠(2008001628344)、SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)健康離乳大鼠(2008001628343),由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司繁育,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2008-0016;小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)(0010028)、微核實(shí)驗(yàn)(0016140)、精子畸形實(shí)驗(yàn)(0015410)選用清潔級(jí)ICR健康小鼠,由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2012-0004?;A(chǔ)飼料,蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司制備提供。
鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102以及S-9來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院。S-9蛋白質(zhì)含量為36.24 mg/mL,每100 mL S-9混合液中加10 mL S-9;羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell,SRBC)、豚鼠血清、雞紅細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自采制備;YAC-1細(xì)胞 上海派通生物科技有限公司;2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB) 醫(yī)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑公司;印度墨汁 北京篤信精細(xì)制劑廠;伴刀豆球蛋白A(concanvalin A,Con A) 華美生物工程公司;噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)韓國(guó)Biosharp公司。
1.2 儀器與設(shè)備
JJ-100電子天平 常熟市雙杰測(cè)試廠;DNP-9162BS電熱培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SX-700高壓滅菌器 日本Tomy公司;KYC-100C型恒溫?fù)u床 上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Spectra Max M2e多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Forma公司;7100型全自動(dòng)生化分析儀 日立高新技術(shù)(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司;ADVIA 2120i血液分析儀 德國(guó)Siemens公司。
1.3 方法
1.3.1 小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)
采用最大耐受量(maximum tolerated dose,MTD)法進(jìn)行小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn),選用清潔級(jí)ICR健康成年小鼠20 只(雌雄各半),體質(zhì)量為18.6~21.5 g,實(shí)驗(yàn)前禁食16 h。配制最大質(zhì)量濃度為含番茄紅素133.32 mg/mL樣品,按最大灌胃量20 mL/kg(以體質(zhì)量計(jì),下同)一次性給藥,受試物番茄紅素的給藥劑量為2 666.64 mg/kg。連續(xù)觀察14 d,記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。
1.3.2 Ames實(shí)驗(yàn)
分別在加與不加S-9混合液的情況下,以1 111.11、222.22、44.44、8.89、1.76 μg/皿的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)劑量組做3 個(gè)平行平皿?;罨到y(tǒng)為多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿制備的S-9混合液。陽(yáng)性組:不加S-9者為敵克松(TA97、TA98、TA102)、疊氮鈉(TA100),加S-9者為2-氨基芴(TA97、TA98、TA100)、1,8-二羥基蒽醌(TA102);同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(自發(fā)回變組和二甲基亞砜組);樣品用二甲基亞砜配制成11.11、2.22、0.44、0.09、0.02 mg/mL劑量組,加樣量0.1 mL/皿。在2 mL頂層瓊脂中加入0.1 mL實(shí)驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL受試樣品溶液和0.5 mL S-9混合液,混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。如果受試樣品組的回變菌落數(shù)是陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)的2 倍以上,并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系則為陽(yáng)性。
1.3.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)
選用體質(zhì)量25~30 g的ICR清潔級(jí)小鼠50 只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 個(gè)組,每組10 只,雌雄各半。以環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)為陽(yáng)性對(duì)照組,受試樣品按照人體推薦劑量的480、240、120 倍設(shè)高、中、低劑量組,分別含受試樣品質(zhì)量濃度為111.11、55.56、27.78 mg/mL,以20 mL/kg劑量灌胃,采用30 h給受試物法。兩次給受試樣品間隔24 h,第二次給受試樣品后6 h處死小鼠,取胸骨常規(guī)制片、鏡檢。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000 個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocytes,PCE),觀察含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)并計(jì)算微核發(fā)生率,以千分率計(jì),結(jié)果采用Poisson分布U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。每只小鼠計(jì)數(shù)200 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞時(shí)所觀察到的成熟紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)數(shù),并計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值(PCE/RBC)。
1.3.4 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)
選用體質(zhì)量25~35 g的ICR清潔級(jí)性成熟雄性小鼠25 只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組。取質(zhì)量濃度為111.11、55.56、27.78 mg/mL的樣品以20 mL/(kg?d)劑量灌胃小鼠,連續(xù)5 d。于首次給受試樣品后的第35天處死小鼠,取兩側(cè)附睪精子濾液按常規(guī)方法制片、鏡檢。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000 個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子,計(jì)算精子畸形發(fā)生率(以百分率計(jì)),結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.3.5 30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
選用SPF級(jí)SD健康離乳大鼠80 只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組,雌雄各半。受試樣品摻入基礎(chǔ)飼料中飼喂大鼠,對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料,按人體推薦劑量的30、65、100 倍,設(shè)200、433.33、666.67 mg/(kg?d)低、中、高3 個(gè)劑量組,受試樣品摻入基礎(chǔ)飼料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.20%、0.43%、0.67%,連續(xù)喂養(yǎng)30 d,測(cè)定各劑量組大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類等血液常規(guī)指標(biāo),以及血清生化指標(biāo)。
1.3.6 Con A誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞活性測(cè)定
按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[25]相關(guān)規(guī)定,以相當(dāng)于受試樣品人體推薦攝入量的5、10、30 倍,設(shè)33.33、66.67、200 mg/(kg?d)這3 個(gè)劑量組,以不加樣品的溶劑為陰性對(duì)照組,每日1 次經(jīng)口給予小鼠,灌胃量0.1 mL/10 g,連續(xù)灌胃30 d。頸椎脫臼法處死小鼠,無(wú)菌取脾臟并研磨為單細(xì)胞懸液,過(guò)200 目篩,以無(wú)菌Hank’s液洗滌兩次,1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。
脾細(xì)胞使用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸為濃度3×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,1 mL/孔接種于24孔培養(yǎng)板中,加入75 ?L 100 ?g/mL的Con A溶液,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,不加Con A溶液孔為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔移除0.7 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)液,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液與50 ?L 5 mg/mL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入1 mL酸性異丙醇終止反應(yīng),吹打混勻后移入96 孔培養(yǎng)板中,每孔3 個(gè)平行對(duì)照,酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品光密度(OD570nm)值,按照公式(1)計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖能力。
無(wú)菌脾單細(xì)胞懸液加入0.5 mL無(wú)菌水裂解紅細(xì)胞20 s,Hank’s液洗滌兩次后,使用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。取4×105個(gè)/mL濃度的YAC-1靶細(xì)胞與脾細(xì)胞各100 ?L接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,以YAC-1細(xì)胞100 ?L+培養(yǎng)液100 ?L為YAC-1細(xì)胞自然釋放孔,以YAC-1細(xì)胞100 ?L+2.5% Triton 100 ?L為YAC-1細(xì)胞最大釋放孔,每個(gè)檢測(cè)樣品設(shè)3 個(gè)平行孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。1 500 r/min離心96 孔培養(yǎng)板5 min,每孔吸取100 ?L上清液,加入乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)基質(zhì)液100 ?L反應(yīng)10 min,每孔加入1 mol/L HCl 30 ?L,于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD490nm)值,按照公式(2)計(jì)算NK細(xì)胞活性。
1.3.7 DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity,DTH)
各劑量組番茄紅素連續(xù)灌胃30 d后,剃除小鼠腹部3 cm×3 cm鼠毛,均勻涂抹50 ?L 10 mg/mL DNFB溶液致敏。5 d后,以10 ?L 10 mg/mL DNFB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊,24 h后頸椎脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼,以打孔器取下8 mm耳片稱質(zhì)量,按照公式(3)計(jì)算DTH程度。
1.3.8 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)及血清溶血素水平測(cè)定
連續(xù)灌胃30 d后,每鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)2%的SRBC懸液0.2 mL進(jìn)行免疫,4 d后頸椎脫臼處死小鼠,無(wú)菌取脾臟制備5×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液。將表層培養(yǎng)基與2×Hank’s液1∶1(V/V)混勻分裝為0.5 mL每管,加入50 ?L以乙酸鈉緩沖液(sodium acetate buffer,SA)緩沖液配制的體積分?jǐn)?shù)10% SRBC懸液、20 ?L新鮮制備的脾細(xì)胞懸液,混勻傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上,每個(gè)樣品做兩個(gè)平行片,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h,將新鮮豚鼠血清補(bǔ)體1∶8(V/V)稀釋后加入玻片架凹槽內(nèi),繼續(xù)孵育1.5 h后,計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。
小鼠腹腔注射SRBC懸液免疫4 d后,摘眼球法取血,全血靜置1 h,2 000 r/min離心10 min收集血清。血清200 倍稀釋后,加入體積分?jǐn)?shù)5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL、補(bǔ)體0.5 mL,37 ℃溫育30 min,2 000 r/min離心10 min取上清液1 mL加入3 mL都氏試劑中,靜置10 min后于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品管及SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度(OD540nm)值,溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示,按照公式(4)計(jì)算HC50。
1.3.9 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)
小鼠連續(xù)灌胃30 d后,每鼠按0.1 mL/10 g尾靜脈注射4 倍稀釋的印度墨汁,墨汁注入后立即計(jì)時(shí)。注射墨汁后2 min及10 min時(shí)分別從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20 ?L,加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的光密度值,按照公式(5)、(6)計(jì)算吞噬指數(shù)(α)。
式中:K為廓清指數(shù);OD1為t1時(shí)的光密度值;OD2為t2時(shí)的光密度值;t1為2 min,t2為10 min。
1.3.10 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
小鼠連續(xù)灌胃30 d后,每鼠腹腔注射1 mL體積分?jǐn)?shù)20%雞紅細(xì)胞懸液,30 min后頸椎脫臼法處死小鼠,腹腔注入2 mL生理鹽水潤(rùn)洗1 min,吸出腹腔洗液于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min,于生理鹽水中漂洗晾干,丙酮-甲醇溶液1∶1(V/V)固定,體積分?jǐn)?shù)4%的Giemsa-磷酸鹽緩沖液染色3 min,蒸餾水漂洗晾干封片,光鏡下進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù),按照公式(7)、(8)計(jì)算HC50。
1.4 數(shù)據(jù)分析
各組實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析,滿足方差齊性的數(shù)據(jù)使用單因素方差分析中多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;對(duì)非正態(tài)或方差不齊性的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,滿足方差齊性要求后進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異顯著。骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Poisson分布U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表1 番茄紅素小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 1 Acute oral toxicity of lycopene in mice (x±s)
由表1可知,實(shí)驗(yàn)期間番茄紅素對(duì)小鼠體質(zhì)量無(wú)影響,各組小鼠飲食和活動(dòng)正常,生長(zhǎng)良好,未見中毒表現(xiàn),無(wú)死亡小鼠,雌、雄小鼠的番茄紅素經(jīng)口MTD>2 666.64 mg/kg,屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。
2.2 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2 番茄紅素Ames實(shí)驗(yàn)回變菌落數(shù)(x±s=6)Table 2 Colony variation number per vessel after administration of lycopene in Ames test(x±s=6)
參照文獻(xiàn)[25]方法,Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,番茄紅素各劑量組回變菌落數(shù)均未超過(guò)陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)的2 倍,亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系。即番茄紅素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102這4 株實(shí)驗(yàn)菌株在加與不加S-9時(shí),均未見有致基因突變作用。
2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表3 番茄紅素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率及PCE/RBC值的影響Table 3 Effect of lycopene on bone marrow cell micronucleus and PCE/RBC ratio in mice
由表3可知,番茄紅素各劑量組微核率與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),而陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺)則極顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)。未見番茄紅素對(duì)小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核形成及PCE/RBC比值產(chǎn)生影響。
2.4 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表4 番茄紅素對(duì)小鼠精子畸形率的影響(x±s=6)Table 4 Effect of lycopene on teratospermia ratio in mice(x±s=6)
表5 番茄紅素對(duì)小鼠精子畸形類型及比例的影響Table 5 Effect of lycopene on sperm malformation type and ratio in mice
由表4、5可知,番茄紅素各劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組(劑量為0)比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05),而陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺)小鼠精子畸形率與陰性對(duì)照組比較有極顯著提高(P<0.01)。因此,番茄紅素對(duì)小鼠精子畸形率未產(chǎn)生影響。
2.5 番茄紅素對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響
表6 番茄紅素對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響(x±s)Table 6 Effect of lycopene on haematological indexes in rats(x±s)
由表6可知,番茄紅素各劑量組大鼠的各項(xiàng)血液常規(guī)指標(biāo)與陰性對(duì)照組(劑量為0)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.6 番茄紅素對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響
經(jīng)口給予大鼠不同劑量的番茄紅素30 d,測(cè)定各組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活力和總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐及血糖的水平。如表7所示,番茄紅素各劑量組各項(xiàng)血液生化指標(biāo)與陰性對(duì)照組(劑量為0)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表7 番茄紅素對(duì)大鼠部分血清生化指標(biāo)的影響(x±s)Table 7 Effect of lycopene on blood biochemical parameters in rats(x±s)
2.7 番茄紅素對(duì)小鼠免疫功能的影響
小鼠經(jīng)口給予不同劑量番茄紅素30 d后,33.33、66.67、200 mg/(kg?d)劑量組小鼠平均終末體質(zhì)量、體質(zhì)量增長(zhǎng)值、胸腺與脾臟的臟/體比與陰性對(duì)照組(劑量為0)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTT法進(jìn)行Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果不滿足方差齊性要求,采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果(表8)表明,番茄紅素各劑量組淋巴細(xì)胞增殖能力與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表8 番茄紅素對(duì)小鼠免疫功能的影響(x±s)Table 8 Effect of lycopene on immune functions in mice (x±s)
采用乳酸脫氫酶法進(jìn)行小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定,將NK細(xì)胞經(jīng)sin—1(P1/2)(P為NK細(xì)胞活性)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行組間t檢驗(yàn)比較,結(jié)果(表8)表明,200 mg/(kg?d)劑量組NK細(xì)胞活性高于陰性對(duì)照組(劑量為0),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而使用耳腫脹法進(jìn)行DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH實(shí)驗(yàn)及小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),番茄紅素各劑量組DTH程度及小鼠吞噬指數(shù)(α)與陰性對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
采用Jerne改良玻片法進(jìn)行小鼠抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn),計(jì)算溶血空斑數(shù),發(fā)現(xiàn)200 mg/(kg?d)劑量組溶血空斑數(shù)高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用半數(shù)溶血值法測(cè)定小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50),結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 mg/(kg?d)劑量組血清半數(shù)溶血值(HC50)高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外,用半體內(nèi)法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn),計(jì)算吞噬指數(shù)及吞噬百分率,并將吞噬百分率經(jīng)sin—1(P1/2)(P為吞噬百分率)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行組間t檢驗(yàn)比較,結(jié)果表明200 mg/(kg?d)劑量組小鼠吞噬指數(shù)高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
食品安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,ICR小鼠對(duì)番茄紅素最大可耐受灌胃劑量高于人體推薦食用量100 倍,屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)。200、433.33、666.67 mg/(kg?d)番茄紅素連續(xù)30 d給藥沒(méi)有對(duì)大鼠的血液生化指標(biāo)產(chǎn)生影響,Ames實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)、骨髓細(xì)胞染色結(jié)果陰性,未見致畸變作用。此外,番茄紅素以33.33、66.67、200 mg/(kg?d)連續(xù)給藥30 d,沒(méi)有對(duì)小鼠的攝食、體質(zhì)量增量、主要免疫器官的臟/體比產(chǎn)生影響。
免疫功能研究結(jié)果顯示,在Con A誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,33.33、66.67、200 mg/(kg?d)劑量組淋巴細(xì)胞增殖能力與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);DNFB誘導(dǎo)的小鼠DTH實(shí)驗(yàn)中,33.33、66.67、200 mg/(kg?d)劑量組DTH程度與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在體液免疫功能方面,抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,200 mg/(kg?d)劑量組溶血空斑數(shù)高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);小鼠血清半數(shù)溶血值實(shí)驗(yàn)中,200 mg/(kg?d)劑量組血清半數(shù)溶血值高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而在單核-巨噬細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)、碳廓清實(shí)驗(yàn)中,番茄紅素各劑量組吞噬指數(shù)α與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),200 mg/(kg?d)劑量組雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中,200 mg/(kg?d)劑量組NK細(xì)胞活性高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜上所述,番茄紅素可以增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞與體液免疫功能。
[1] SAHIN K, ONDERCI M, SAHIN N, et al. Effects of dietary combination of chromium and biotin on egg production, serum metabolites and egg yolk mineral and cholesterol concentration in heat-distressed laying quails[J]. Biological Trace Element Research,2004, 101(2): 181-192.
[2] NONG Qingqing, KOMATSU M, IZUMO K, et al. Involvement of reactive oxygen species in microcystin-LR-induced cytogenotoxicity[J]. Free Radical Research, 2007, 41(12): 1326-1337.
[3] JURANEK I, BEZEK S. Controversy of free radical hypothesis reactive oxygen species: cause or consequence of tissue injury?[J]. General Physiology Biophysics, 2005, 24(3): 263-278.
[4] WEI Y H. Mitochondrial DNA alterations as aging-associated molecular events[J]. Mutation Research, 1992, 275(3/6): 145-155.
[5] ZALATA A A, AHMED A H, ALLAMANENI S S, et al. Relationship between acrosin activity of human spermatozoa and oxidative stress[J]. Asian Journal of Andrology, 2004, 6(4): 313-318.
[6] 徐盟. 心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制與相關(guān)藥物治療的研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用藥物與臨床, 2014(8): 1052-1056.
[7] 沈云峰, 胡遠(yuǎn)貴, 張洪波, 等. 冠心病患者血清胱抑素C、一氧化氮、超氧化物歧化酶及超敏C反應(yīng)蛋白水平變化及與冠脈狹窄程度的相關(guān)性[J]. 微循環(huán)雜志, 2014(3): 28-31.
[8] 羅祖明, 董佑忠, 彭國(guó)光. 腦血管疾病治療學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1999: 455-462.
[9] MANZANERO S, SANTRO T, ARUMUGAM T V. Neuronal oxidative stress in acute ischemic stroke: sources and contribution to cell injury[J]. Neurochemistry International, 2013, 62(5): 712-718.
[10] 楊娜, 李明, 胡家棟, 等. 番茄紅素對(duì)UVA氧化損傷皮膚成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2013(11): 142-147.
[11] 唐湘宇, 孫文清, 王蕾, 等. 番茄紅素對(duì)高脂兔血管脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的影響及機(jī)制探討[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2006, 11(2): 158-163.
[12] 胡敏予, 李毅琳, 劉昭前, 等. 番茄紅素對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的保護(hù)作用[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2007, 29(5): 498-502.
[13] 汪海寧, 李吉林, 姚懷齊, 等. 心肌細(xì)胞肥大中番茄紅素對(duì)自噬的作用[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2013, 10(33): 11-14.
[14] 楊艷暉, 王海霞, 榮勝忠, 等. 番茄紅素對(duì)大鼠急性心肌梗死所致心肌損傷的保護(hù)作用[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2013, 35(5): 471-474.
[15] 曾瑤池, 穆桂萍, 黃淑芬, 等. 番茄紅素對(duì)高糖所致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制初探[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 26(1): 19-23.
[16] 張衛(wèi)國(guó), 謝國(guó)建, 劉先軍, 等. 番茄紅素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)的抑制作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2005, 21(3): 292-295.
[17] TAKESHIMA M, ONO M, HIGUCHI T, et al. Anti-proliferative and apoptosis-inducing activity of lycopene against three subtypes of human breast cancer cell lines[J]. Cancer Science, 2014, 105(3): 252-257.
[18] ERMAN F, TUZCU M, ORHAN C, et al. Effect of lycopene against cisplatin-induced acute renal injury in rats: organic anion and cation transporters evaluation[J]. Biological Trace Element Research, 2014,158(1): 90-95.
[19] 劉秀萍. 番茄紅素對(duì)人體高強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)后氧自由基代謝的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(9): 1025-1027.
[20] 吳麗君, 郭新明, 張俊峰. 番茄紅素及運(yùn)動(dòng)對(duì)人體血清自由基代謝的影響[J]. 體育科學(xué), 2008, 28(2): 47-53.
[21] ZU Ke, MUCCI L, ROSNER B A, et al. Dietary lycopene,angiogenesis, and prostate cancer: a prospective study in the prostatespecific antigen era[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2014: djt430. doi: 10.1093/jnci/djt430.
[22] MARIANI S, LIONETTO L, CAVALLARI M, et al. Low prostate concentration of lycopene is associated with development of prostate cancer in patients with high-grade prostatic intraepithelial neoplasia[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(1): 1433-1440.
[23] 范遠(yuǎn)景, 黃璐. 番茄紅素吸收與體內(nèi)抗氧化的機(jī)理研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(11): 545-548.
[24] 尚德軍, 王軍. 番茄紅素研究現(xiàn)狀與展望[J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué), 2004,14(2): 59-61.
[25] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003年版)[EB/OL]. (2006-01-08)[2014-04-07]. http://www.sdfda.gov.cn/ filedown/admin/12671467264375794242367161.pdf.
Safety Evaluation and Immunoregulatory Effect in Mice of Lycopene
SUN Jie, HU Qi, LI Shifen, ZHONG Yihong, HUAN Fei, WANG Yubang*
(Safety Assessment and Research Center for Drug, Pesticide and Veterinary Drug of Jiangsu Province, School of Public Health,Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)
Objective: To evaluate the safety of lycopene as a food supplement in mice and its effect on immune functions. Methods: A 30-day feeing test was carried out on rats, and mice were employed for acute toxicity test and measured for cellular and humoral immune functions, mononuclear macrophage phagocytosis and natural killer (NK) cell viability. Lycopene at three doses namely 33.33, 66.67 and 200 mg/(kg?d) was administered per os to the mice for up to 30 days. Results: In the acute oral toxicity test, the maximal tolerance dose (MTD) of lycopene for both male and female mice was higher than 2 666.64 mg/kg suggesting that it is actually non-toxic. During the 30-day feeding period, no effects of lycopene at the 200、433.33、666.67 mg/(kg?d) doses were observed on haematological or blood biochemical indexes, and Ames,marrow cell micronucleus and sperm abnormality tests showed negative results. The macrophage phagocytosis index of chicken erythrocytes and NK cell viability in the high-dose group were higher than those in the negative control group with statistical significance (P < 0.05). Conclusions: Lycopene is safe as a food supplement. High-dose lycopene supplementation can boost immunity in mice.
lycopene; immune function; food safety
TS255.4
A
1002-6630(2015)09-0170-06
10.7506/spkx1002-6630-201509031
2014-06-08
江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目
孫杰(1981—),女,講師,博士,主要從事藥理學(xué)研究。E-mail:yssjmm@126.com
*通信作者:王玉邦(1965—),男,副教授,博士,主要從事保健食品安全性與功效研究。E-mail:wyb@njmu.edu.cn