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        二硝基氯苯致大鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的構(gòu)建

        2015-12-13 05:35:40何文鳳張?jiān)畦?/span>王蓬文任映張乙陳怡瑾楊涵雯李璦同
        中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2015年3期
        關(guān)鍵詞:流腦性皮炎變應(yīng)性

        何文鳳張?jiān)畦?王蓬文任 映張 乙陳怡瑾楊涵雯李璦同

        ·論著·

        二硝基氯苯致大鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的構(gòu)建

        何文鳳1張?jiān)畦??王蓬文2任 映2張 乙3陳怡瑾3楊涵雯3李璦同3

        目的: 構(gòu)建二硝基氯苯外用致大鼠背部變應(yīng)性接觸性皮炎模型。方法: 利用二硝基氯苯作為致敏劑,對(duì)大鼠皮膚進(jìn)行致敏和激發(fā)。激發(fā)后24 h取材,觀察皮膚病理改變,利用ELISA法檢測血清IL-4和TNF-α的表達(dá)。結(jié)果: 大鼠背部皮膚激發(fā)24 h后,肉眼可見不同程度的紅斑、腫脹;組織病理示:表皮、真皮內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤;ELISA結(jié)果顯示TNF-α水平升高,IL-4水平降低。結(jié)論:成功構(gòu)建二硝基氯苯誘導(dǎo)的大鼠背部ACD模型,彌補(bǔ)了小鼠ACD模型的不足。

        大鼠; 二硝基氯苯; 變應(yīng)性接觸性皮炎

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物為SPF級(jí)雌性,4~5周齡,SD大鼠14只,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司供給[SCXK(京)2012-0001],飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行[SYXK(京)2009-0028]。

        丙酮溶液(北京化學(xué)試劑公司),二硝基氯苯(上海哈靈科技有限公司),薇婷脫毛膏(利潔時(shí)家化中國有限公司),IL-4、TNF-α ELISA試劑盒(Ebioscience公司),全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3,Thermo,USA)。

        1.2 方法 分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為2組,空白組與模型組,每組7只,兩組均于實(shí)驗(yàn)前1天背部脫毛2處,甲處面積約2 cm×3 cm,乙處面積約4 cm×4 cm(圖1),空白組給予丙酮溶液涂抹,模型組則建立ACD模型。

        大鼠ACD模型的建立:模型組脫毛后24 h于脫毛區(qū)甲處外涂7%的DNCB丙酮溶液致敏,2周后,于脫毛區(qū)乙處外涂0.1%的DNCB丙酮溶液激發(fā)。

        取材激發(fā)后24 h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于麻醉狀態(tài)下采血于

        EP管中,離心處理后分離血清,放入-20℃冰箱下保存待測;取1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm激發(fā)處皮膚固定于10%中性緩沖福爾馬林液中待用。

        1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):大鼠激發(fā)后24 h觀察激發(fā)部位皮膚反應(yīng),皮損的評(píng)分采用趙辨EASI評(píng)分法,2臨床表現(xiàn)分為四項(xiàng),即:紅斑,硬腫(水腫)/丘疹,表皮剝脫,苔蘚化。每一臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重度以0~3分計(jì)分,0分=無,1分=輕,2分=中,3分=重,各種癥狀分值之間可記半級(jí)分,即0.5分。打分原則:0分:無此體征出現(xiàn);1分:此體征存在,但需仔細(xì)觀察才能見到;2分:此體征可立即看到;3分:此體征非常明顯。組織學(xué)觀察4 μm石蠟切片,HE染色,觀察組織病理變化。ELISA檢測IL-4、TNF-α的表達(dá)。操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行,在酶標(biāo)儀450 nm波長檢測各孔的吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)IL-4、TNF-α的表達(dá)量。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示,進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水平為0.05。

        高校書記校長經(jīng)濟(jì)責(zé)任審計(jì)涵蓋的內(nèi)容很多涉及學(xué)校經(jīng)濟(jì)建設(shè)的方方面面,包括:學(xué)校發(fā)展戰(zhàn)略、重大基建項(xiàng)目、大宗物資采購、對(duì)外投資、大額資金使用、大型辦學(xué)和產(chǎn)學(xué)研合作、資產(chǎn)調(diào)整和產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)讓、重大資產(chǎn)對(duì)外租賃、融資擔(dān)保、高端人才引進(jìn)等等,這里主要是介紹一下在高校開展書記校長的經(jīng)責(zé)審計(jì)中如何把握“重大經(jīng)濟(jì)決策事項(xiàng)”的審計(jì)。

        2 結(jié)果

        2.1 肉眼觀察結(jié)果 模型組大鼠背部甲處皮膚致敏后可見明顯紅斑、腫脹及丘疹(圖2)。激發(fā)后24 h觀察模型組大鼠背部乙處皮膚,激發(fā)后乙處皮膚可見明顯彌漫性紅斑、邊界不清,略腫脹(圖3)。其中紅斑嚴(yán)重度輕者1只,占14.3%,中者1只,占14.3%,重者5只,占71.4%。水腫嚴(yán)重度輕者6只,占85.7%,中者1只,占14.3%。

        2.2 鏡下觀察結(jié)果 組織病理學(xué)檢查示:激發(fā)后24 h,模型組大鼠激發(fā)部位皮膚輕度角化過度,表皮、真皮內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖4)。

        圖1 大鼠背部脫毛過程

        圖2 模型組致敏后背部皮膚(甲處)

        圖3 激發(fā)后背部皮膚(乙處)

        圖4 激發(fā)后皮膚病理變化

        2.3 血清IL-4、TNF-α水平 模型組大鼠血清TNF-α的表達(dá)水平較空白組明顯增高(P<0.05),而IL-4的表達(dá)水平較空白組明顯降低(P<0.05)(表1)。

        表1 TNF-α、IL-4在大鼠血清中的表達(dá)

        3 討論

        濕疹、變應(yīng)性接觸性皮炎等與IV型變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的疾病是皮膚科門診常見的疾病之一。世界變態(tài)反應(yīng)組織(WAO)在30個(gè)國家對(duì)過敏性疾病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果,這些國家12億總?cè)丝谥校?.5億人(22%)患有不同種類的過敏性疾病。3其中皮膚變態(tài)反應(yīng)更為高發(fā),20%的人口受其困擾,4全球僅抗變態(tài)反應(yīng)藥物這一項(xiàng)的支出已超過80億美元。5

        建立可靠的ACD動(dòng)物模型,不但可用于該類疾病發(fā)病機(jī)制的研究,更是臨床前研究藥物療效的保障。幾十年來,人們最常選用小鼠耳廓建立ACD模型,該模型常用于篩選治療該類疾病藥物的藥效學(xué)研究,但小鼠ACD模型的靶皮損多取耳廓,觀察指標(biāo)多為耳廓的腫脹度等,而不利于對(duì)皮損中紅斑、水腫、表皮剝脫、苔蘚化等的整體狀況研究。本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠背部皮膚作為研究對(duì)象,用DNCB誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎,從紅斑、水腫、表皮剝脫、苔蘚化等多方面觀察,更符合變態(tài)反應(yīng)性皮膚炎癥的皮損表現(xiàn)。ACD是典型的IV型遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。由CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo),Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α起上調(diào)作用,Th2型細(xì)胞因子IL-4起下調(diào)作用。6Th1/Th2失衡引起細(xì)胞因子分泌異常在ACD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Th1、Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子之間存在互相拮抗的作用,IL-4能抑制IFN-γ的產(chǎn)生,下調(diào)Th1細(xì)胞分化;相反,IL-4促進(jìn)Th2細(xì)胞分化。本研究觀察到,DNCB誘導(dǎo)ACD大鼠模型血清中TNF-α明顯升高,而IL-4降低,提示DNCB誘導(dǎo)ACD模型為Th1型免疫反應(yīng),這與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。7,8

        本實(shí)驗(yàn)中,ACD模型組大鼠背部激發(fā)處皮膚表現(xiàn)以彌漫性紅斑、腫脹為主,組織病理結(jié)果示有大量炎癥細(xì)胞浸潤,與典型的接觸性皮炎病理相符,9說明本實(shí)驗(yàn)成功建立大鼠背部ACD模型。

        本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠背部的ACD模型,為背部皮炎模型代替耳廓皮炎模型提供了可行性,背部模型腫脹度高、易于肉眼判斷,且大鼠背部面積大,可以分成多個(gè)區(qū)域進(jìn)行試驗(yàn)及取材,不僅便于直接觀察,更適于抗變態(tài)反應(yīng)藥物的藥效研究。

        在現(xiàn)有工作中,以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立ACD模型的文章較少,故該次造模的工作重點(diǎn)在于找到合適的實(shí)驗(yàn)方法以成功建立大鼠ACD模型。包括選擇合適的致敏劑濃度、掌握好致敏與激發(fā)的間隔時(shí)間等,因此在炎癥相關(guān)因子的檢測方面有所欠缺,對(duì)采用大鼠ACD模型進(jìn)行變應(yīng)性接觸性皮炎藥物療效觀察方面未能有更多指導(dǎo)。在后續(xù)試驗(yàn)中,我們將在成功建立大鼠ACD模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)行各類炎癥相關(guān)因子的檢測以進(jìn)一步證實(shí)大鼠ACD模型的實(shí)用性。

        1王國江,顧軍.小鼠背部變應(yīng)性接觸性皮炎模型的建立.中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2004,31(1):17-19.

        2趙辨.濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法.中華皮膚科雜志,2004,37(1):3-4.

        3尹佳.2005年7月8日是首個(gè)世界過敏性疾病日.中華醫(yī)學(xué)雜志,2005,85(25):1769-1769.

        4 Laughter D,Istvan JA,Tofte SJ,et al.The prevalence of atopic dermatitis in oregon schoolchildren.J American Academy Dermatol,2000,43(4):649-655.

        5劉瑞玲.過敏性疾病的診斷與治療.中國臨床醫(yī)生,2003,1 (9):4-5.

        6郭麗芳,范衛(wèi)新,湯愛民.兩種變應(yīng)原致小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的研究.中華皮膚科雜志,2005,38(4):229-231.

        7 Hopkins JE,Naisbitt DJ,Kitteringham NR,et al.Selective haptenation of cellular or extracellular protein by chemical aller-

        gens:association with cytokine polarization.Chemical Research in Toxicology,2005,18(2):375-381.

        8李敏,關(guān)洪全.疏風(fēng)飲對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及 IFN-γ與 IL-4分泌的影響.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2011,25(1):24-25.

        9陳錫唐,劉季和,丘丙森,等.實(shí)用皮膚組織病理學(xué).廣州:廣東科技出版社,1994.163-167.

        (收稿:2014-09-08 修回:2014-10-21)

        圖1 頭面、頸、前胸、腹部彌漫充血水腫性紅斑,其上可見松弛性大皰、膿皰,大片糜爛、滲出??谥堋⒀鄄€周圍滲出、結(jié)痂,口周呈放射狀皸裂 圖2 背部彌漫充血水腫性紅斑,其上可見松弛性大皰、膿皰,大片糜爛、滲出

        診斷:金黃色葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征。

        治療:給予I級(jí)護(hù)理,流質(zhì)飲食;頭孢曲松鈉0.70 g/日分2次(患兒13 kg)靜滴抗感染,5%葡萄糖注射液、維生素C靜滴營養(yǎng)支持。軀干、四肢、外陰以1%乳酸依沙吖啶溶液濕敷,干燥結(jié)痂處外涂莫匹羅星軟膏,眼部以金霉素軟膏每日專項(xiàng)護(hù)理,口腔以碳酸氫鈉溶液每日專項(xiàng)護(hù)理。經(jīng)上述綜合治療,患者病情逐漸好轉(zhuǎn),7天后基本痊愈,好轉(zhuǎn)出院。

        討論 金黃色葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征(簡稱SSSS)是由凝固酶陽性、第2噬菌體組金黃色葡萄球菌感染并分泌表皮剝脫毒素引起的一種以全身性紅斑、松弛性大皰及大片表皮剝脫為特征的水皰性急性嚴(yán)重性皮膚病,具有接觸傳染性,主要累及新生兒和幼兒,個(gè)別病例可出現(xiàn)危重癥,病死率高達(dá)3%~4%。2與預(yù)防接種有關(guān)的SSSS極為罕見,既往文獻(xiàn)中,僅報(bào)道過1例與接種流感疫苗相關(guān)的小兒SSSS,3但未見因接種流腦疫苗引起該病的報(bào)道。本例患兒接種流腦疫苗2天后,軀干即出現(xiàn)紅斑、水皰、膿皰,迅速波及全身,繼發(fā)糜爛、滲出,口周、眼瞼周圍滲出、結(jié)痂,口周呈放射狀皸裂。實(shí)驗(yàn)室檢查:白細(xì)胞升高,皰液培養(yǎng)檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,符合SSSS表現(xiàn),診斷成立。追問病史,患兒在發(fā)病前1個(gè)月內(nèi),除接種過流腦疫苗外,未接種過其他疫苗,無其他藥物應(yīng)用史。綜合既往用藥史、臨床癥狀及體征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,認(rèn)為:該患兒發(fā)生SSSS與接種流腦疫苗關(guān)系較大。其原因可能與接種操作流程不規(guī)范、消毒措施不當(dāng)至直接細(xì)菌感染或交叉感染有關(guān)。同時(shí),也不排除該患兒接種流腦疫苗后所啟動(dòng)的免疫應(yīng)答導(dǎo)致免疫功能紊亂,從而增加了發(fā)生SSSS的機(jī)會(huì)。

        本例為1例疑似因接種流腦疫苗引起SSSS的個(gè)案,應(yīng)當(dāng)引起有關(guān)部門的重視,加強(qiáng)安全接種,嚴(yán)格遵守操作規(guī)程,避免接種反應(yīng)的發(fā)生。

        參考文獻(xiàn)

        1楊聲坪,李婧媛.國內(nèi)流腦疫苗預(yù)防接種不良反應(yīng)評(píng)價(jià).中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2011,11(12):1468-1470.

        2樊翌明,吳志華.葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征的研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊(cè),2002,28(1):22-24.

        3苗吉?jiǎng)?,龐?qiáng).1例因接種流感疫苗引起的金黃色葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征報(bào)告.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2009,15(11):1164.

        (收稿:2013-12-21 修回:2014-01-21)

        Construction of rats model for allergic contact dermatitis induced by DNCB

        HE Wen-feng,ZHANG Yun-bi,WANG Peng-wen,et al.Department of Dermatology,Dongzhimen Hosipital,BUCM,Beijing,100700

        Objective:To construct a rat model for allergic contact dermatitis(ACD)induced by DNCB. Methods:The dorsal skin in rats was sensitized and challenged with DNCB.The histopathologic examination of lesions was done 24 hours after challenge and the levels of TNF-α and IL-4 in serum were detected with ELISA.Results:Different degrees of erythema and edema were observed in lesions after 24 hours challenge. Biopsy showed inflammatory cells infiltration.ELISA showed the level of TNF-α was increased and the level of IL-4 was decreased.Conclusion:The model of rat model for ACD was constructed successfully,which made up for the lack of mice model for ACD.

        rats;dinitrochlorobenzene;allergic contact dermatitis

        1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院皮膚科,北京,100700 2北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,100700 3北京中醫(yī)藥大學(xué),北京,100029

        ?通信作者

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