翟清　楊志偉　石鑫磊　范純玲

[摘要] 目的 建立蒲黃用檸檬黃非法染色的檢查方法。 方法 采用TLC法、HPLC-PAD法，對(duì)多批次蒲黃樣品進(jìn)行定性定量分析。 結(jié)果 經(jīng)檢測(cè)10批市售樣品中，有6批檢出檸檬黃，其含量在0.05～0.50mg/g。 結(jié)論 蒲黃染色除用化工原料金胺O外，還有用檸檬黃染色現(xiàn)象，本文所建立的檢測(cè)方法，可以滿足蒲黃用檸檬黃染色定性定量的要求。

[關(guān)鍵詞] 蒲黃；檸檬黃；TLC法；HPLC-PDA法

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）19-69-04

[Abstract] Objective Establish inspection methods Typhae Pollen illegal stained with tartrazine. Methods The technique of TLC and HPLC-PAD were developed for qualitation and quantitative analysis mutiple batches of samples Typhae Pollen.Results After testing 10 batches of commercial samples， six batches detected in lemon yellow， its content in the 0.05-0.50mg/g. Conclusion The use of chemical raw materials except Typhae Pollen staining outside auramine， there are lemon yellow staining phenomenon， The method established in this paper， to meet with tartrazine stain Typhae Pollen qualitative and quantitative requirements.

[Key words] Typhae Pollen； Tartrazine； TLC； HPLC-PDA

蒲黃收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部，為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifolia L.、東方香蒲Typha orientalis Presl或同屬植物的干燥花粉。具有止血，化瘀，通淋的功效，用于吐血，衄血，咯血，崩漏，外傷出血，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹刺痛，跌撲腫痛，血淋澀痛[1]。為中醫(yī)臨床常用中藥，也是多種中成藥的原料藥?，F(xiàn)代研究證明具有鎮(zhèn)痛、抗凝促凝（與濃度有關(guān)）、促進(jìn)血液循環(huán)、降低血脂、防止動(dòng)脈硬化、保護(hù)高脂血癥所致的血管內(nèi)皮損傷、興奮收縮子宮、增強(qiáng)免疫力等作用，還有促進(jìn)腸蠕動(dòng)、抗炎、抗低壓低氧、抗微生物等藥理作用，臨床有廣泛的用途[2-4]。由于中藥材市場(chǎng)經(jīng)營(yíng)比較混亂，摻雜使假現(xiàn)象比較嚴(yán)重，經(jīng)過市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒲黃偽品多為該植物非藥用部位的粉末，經(jīng)過染色按正品銷售使用，染色多用化工原料金胺O進(jìn)行非法染色[5-8]，但由于近年來藥監(jiān)部門加大了中藥非法染色的打擊力度，金胺O染色現(xiàn)象有所減少，但仍有一些不法商販將蒲黃偽品用檸檬黃非法染色。檸檬黃，又稱酒石黃、酸性淡黃、肼黃。化學(xué)名稱為1-（4-磺酸苯基）-4-（4-磺酸苯基偶氮）-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉鹽，為水溶性合成色素。呈鮮艷的嫩黃色，是單色品種。多用于食品、飲料、化妝品、飼料、煙草、玩具、食品包裝材料等的著色，也用于羊毛、蠶絲的染色及制造色淀[9]。檸檬黃不是蒲黃應(yīng)有的化學(xué)成分，在藥學(xué)領(lǐng)域主要用于膠囊殼的著色劑[10]。筆者通過TLC法，HPLC-PAD法，鑒定證明蒲黃所用染料除金胺O外，還有用檸檬黃染色問題，并建立了檢查方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

昆山市超聲儀器有限公司KQ-400KDB型超聲波清洗機(jī)；Linomat 5卡瑪半自動(dòng)點(diǎn)樣儀；Waters2695-2988，PAD檢測(cè)器，Empower 2色譜工作站。

1.2 試藥

檸檬黃對(duì)照試劑購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：10002，蒲黃對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121225-201003。蒲黃藥材、飲片購(gòu)自吉林省各地區(qū)的市售樣品。薄層色譜板為硅膠G薄層色譜板，購(gòu)自青島海洋化工廠分廠；水為超純水，經(jīng)檢驗(yàn)合格，甲醇為色譜純，醋酸銨為分析純。

2 方法

2.1 TLC檢查

2.1.1 對(duì)照試劑溶液的制備 取檸檬黃對(duì)照試劑適量，加甲醇制成0.2mg/mL的溶液，作為對(duì)照試劑溶液Ⅰ（TLC用）。取檸檬黃對(duì)照試劑溶液Ⅰ適量，加甲醇制成50μg/mL的溶液，作為對(duì)照試劑溶液Ⅱ（HPLC用）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取蒲黃粉末1g，加甲醇20mL，密塞，超聲處理20min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取蒲黃對(duì)照藥材1g，加甲醇20mL，密塞，超聲處理20min，濾過，取濾液作為陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 TLC試驗(yàn) 取上述對(duì)照試劑溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1︰3︰3︰1︰1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，陽性樣品在與對(duì)照試劑色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照在與對(duì)照試劑色譜相應(yīng)的位置上，則不顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖1）。

2.2 金胺O的HPLC-PAD法確認(rèn)

2.2.1 色譜條件 色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.05mol/L醋酸銨溶液（20︰80）為流動(dòng)相；采用二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為423nm。理論塔板數(shù)按檸檬黃對(duì)照試劑色譜中的主峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。endprint

2.2.2 測(cè)定法 吸取供試品溶液與對(duì)照試劑溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖2）。

2.2.3 專屬性檢查 為了證明該方法具有專屬性，將對(duì)照試劑溶液，含金胺O樣品、陰性樣品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜的考察，結(jié)果薄層色譜含有檸檬黃的樣品溶液呈現(xiàn)與檸檬黃對(duì)照試劑保留時(shí)間相同的色譜峰；比較200～600nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見吸收光譜，吸收光譜相同。陰性樣品溶液未檢出與檸檬黃對(duì)照試劑相同的色譜峰。從而證明該補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目具有專屬性。

2.3 HPLC檢查方法的建立與驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍考察 精密稱取檸檬黃對(duì)照試劑適量， 加甲醇制成5.49、10.98、21.96、43.92、87.84μg/mL的溶液，分別精密吸取10?L進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程Y=4051375.3501X-731.5417 （r=1.0000），結(jié)果表明檸檬黃在0.0549～ 0.8784?g范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，符合外標(biāo)法測(cè)定的要求。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在同一色譜條件下，重復(fù)6次，每次10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定其檸檬黃色譜峰面積值，計(jì)算RSD=0.1%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在同一色譜條件下，24h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10?L，測(cè)定檸檬黃色譜峰面積，RSD=0.1%，結(jié)果表明24h內(nèi)供試品溶液中檸檬黃基本穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一供試品6份，分別按供試品溶液制備的方法制成供試品溶液，取對(duì)照試劑溶液及上述供試品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果6份樣品均檢出檸檬黃。確定所采用的檢查方法具有重現(xiàn)性。

2.3.5 耐用性 通過用同一供試品溶液的3支色譜柱進(jìn)樣，證明了采用的方法在實(shí)驗(yàn)條件有所改變時(shí)，該方法仍然適用。

2.3.6 回收率 精密稱取已知含量的供試品粉末（檸檬黃含量為0.03%）6份，每份約0.5g，分別精密加入檸檬黃對(duì)照試劑溶液（0.1098mg/mL）1.4mL，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)得檸檬黃的平均回收率為98.61%，RSD=0.5%。見表1。

2.3.7 樣品測(cè)定 取市售姜黃樣品10批，按上述方法測(cè)定檸檬黃含量，結(jié)果有6批含有檸檬黃，含量在0.05～0.50mg/g。見表2。

3 結(jié)果

薄層色譜試驗(yàn)中，陽性樣品在與對(duì)照試劑色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照在與對(duì)照試劑色譜相應(yīng)的位置上，則不顯相同顏色的斑點(diǎn)。經(jīng)過HPLC-PAD法確認(rèn)，陽性樣品色譜圖中，在與對(duì)照試劑相同保留時(shí)間有相同的色譜峰，陰性對(duì)照無相應(yīng)的色譜峰，進(jìn)一步證明方法的準(zhǔn)確性。

4 討論

檸檬黃，為水溶性合成色素，是食品常用的染色劑之一，在不同食品中的使用限量不同，最高使用向量均為0.5mg/g，通常情況下，在常規(guī)用量下使用是安全的[9]，但不是蒲黃應(yīng)有的化學(xué)成分，而是個(gè)別商販為了銷售蒲黃偽品而染的色素，并且檸檬黃對(duì)敏感人群而言，少量即可產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)（包括支氣管哮喘）[11]。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的檸檬黃含量雖未超出使用的最高限量，但在臨床使用仍純?cè)谝欢L(fēng)險(xiǎn)。

染色的樣品均為偽品蒲黃，經(jīng)過顯微鑒定可以確定為該植物非藥用部位的粉末加部分沙土組成[12-13]，甚至不含或少含蒲黃花粉粒，經(jīng)過染色使其近似蒲黃的顏色，原來多用金胺O進(jìn)行染色，由于藥監(jiān)部門加大了打擊力度，又開始使用檸檬黃對(duì)藥材非法染色。

在制備供試品溶液時(shí)，對(duì)甲醇、乙醇提取分別進(jìn)行了考察，結(jié)果根據(jù)薄層色譜法所顯斑點(diǎn)顏色深淺和液相色譜峰的大小，判斷用甲醇提取，提取率較高；提取方法采用加熱回流和超聲處理兩種方法進(jìn)行考察，結(jié)果超聲處理優(yōu)于回流提取。

從表2可以看出，10批樣品中有6批檢出檸檬黃，TLC法和HPLC法測(cè)定結(jié)果一致，沒有誤判現(xiàn)象。

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（收稿日期：2015-05-27）endprint