王丹丹　汲　軍

不同濃度姜黃素抑制人肝癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究※

王丹丹汲軍

目的探討姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的抑制作用。方法將不同濃度的姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞株HepG2，藥物作用48 h后，利用四唑鹽比色法（MTT）測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果不同濃度姜黃素（10、20、30、40、50 μg/ml）的抑制率分別為0.437、0.530、0.662、0.781、0.846。與空白對(duì)照組比較，姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有明顯的抑制作用。結(jié)論姜黃素可以明顯抑制HepG2的生長(zhǎng)。

姜黃素；人肝癌細(xì)胞；四甲基偶氮唑鹽

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在腫瘤發(fā)病率中列第3位[1]。肝癌一旦確診，多數(shù)屬于中晚期，常用的放化療方法雖有一定療效，但患者常因嚴(yán)重的不良反應(yīng)而放棄治療，目前抗腫瘤的熱點(diǎn)集中于尋找高效低毒的中藥制劑進(jìn)行治療。姜黃素是從姜黃中提取的有效成分，具有不良反應(yīng)小、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，以往研究表明，其對(duì)胃癌、皮膚癌、結(jié)腸癌等均有一定抑制作用[2]。本實(shí)驗(yàn)主要研究姜黃素在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制效果，探討姜黃素的抗腫瘤活性，以期為姜黃素的體內(nèi)活性及臨床應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)Forma公司；Olympus倒置顯微鏡：日本 Olympus公司；Bio-RAD550全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)5810R型：美國(guó)Eppendorf公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司；小牛血清（FBS）：杭州四季青；無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）、分析純：美國(guó)Sigma公司；胰酶：美國(guó)Sigma公司；姜黃素（含量＞80%）：美國(guó)Sigma公司；人肝癌細(xì)胞株HepG2：上海生物制品研究所，液氮中凍存保種。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)采用加入小牛血清(FBS)并含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2，置于37.5 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，72 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用0.25%胰酶直接吹打法將貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞傳代，每1～2天更換1次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組空白對(duì)照組：以RPMI-1640培養(yǎng)基和細(xì)胞（含0.1% DMSO）為對(duì)照；實(shí)驗(yàn)組：姜黃素粉劑用少量DMSO溶解，配制濃度分別為10、20、30、40、50 μg/ml，每孔加入含 0.1% DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基、細(xì)胞和相應(yīng)濃度的姜黃素。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察加藥培養(yǎng)48 h后，將各組的肝癌細(xì)胞HepG2在倒置顯微鏡下放大200倍觀察細(xì)胞變化并拍照。

1.2.4MTT檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞株增殖的影響按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將HepG2細(xì)胞株以濃度為1×104個(gè)/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的姜黃素溶液200 μl/孔，每組設(shè)6個(gè)平行孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/mlMTT溶液20 μl，作用4 h，棄上清，加入DMSO溶液150 μl/孔振蕩10 min。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)，空白孔調(diào)零，測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率IR=（1－實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度）×100%。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察空白組細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)伸展，成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，見圖 1（1-1）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積縮小呈圓形，與周圍的細(xì)胞脫離，生長(zhǎng)受到抑制。不同濃度姜黃素（10、20、30、40、50 ug/ml）對(duì)細(xì)胞影響見圖1（1-2～1-6）。

2.2MTT法測(cè)定姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖抑制率姜黃素作用48 h后，用MTT法測(cè)定光密度后，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，結(jié)果見表 1，抑制曲線見圖2。結(jié)果可見，不同濃度姜黃素（10、20、30、40、50 μg/ml）的抑制率分別為43.7%、53.0%、66.2%、78.1%、84.6%。與空白對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2均有明顯的抑制作用。

圖1　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

表1　姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用

圖2　姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制曲線

3　討論

目前，惡性腫瘤發(fā)病率極高，腫瘤藥物在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，機(jī)體也會(huì)受到藥物的損害，因此尋找高效低毒的中藥治療勢(shì)在必行[3]。本實(shí)驗(yàn)主要采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與 MTT法相結(jié)合，研究了姜黃素在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞 HepG2的抑制效果。結(jié)果表明，姜黃素體外可明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，并且這種抑制作用有量效關(guān)系，以上實(shí)驗(yàn)其結(jié)果為姜黃素這種低毒的中藥成分用于體內(nèi)的抗腫瘤活性研究提供了科學(xué)依據(jù)，是臨床藥物開發(fā)的基礎(chǔ)研究。

[1] 劉允怡.肝癌治療新進(jìn)展[J].臨床外科雜志,2007,15(1):2-5.

[2] 潘國(guó)鳳.姜黃素抗腫瘤作用及其機(jī)制研究最新進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床,2007,23(5):243-244.

[3] 胡惠軍,陳新來,潘勇權(quán),等.姜黃素對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)化的逆轉(zhuǎn)作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2013,21(7):1425-1429.

Experimental Study of Different Concentrations of Curcumin Inhibits the Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma Cells

Wang DandanJi Jun

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of curcumin on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2.MethodsThe effects of different concentrations of curcumin in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2,the role of drugs after 48 h,using four tetrazolium colorimetric assay(MTT)determination of absorbance, calculate the inhibition rate of cell proliferation.ResultsDifferent concentrations of curcumin(10,20,30,40,50 μg/ml) inhibition rates were 0.437,0.530,0.662,0.781,0.846.Compared with the blank control group,curcumin has obvious inhibitory effect on hepatoma cell line HepG2.ConclusionCurcumin can inhibit the growth of HepG2.

Curcumi;Human hepatocellular carcinoma cell;MTT

R735.7

A

1673-5846(2015)02-0014-02

長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林長(zhǎng)春130031

※吉林省教育廳“十二五”科研規(guī)劃項(xiàng)目（2014610號(hào)）

王丹丹（1981-），碩士學(xué)位，主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。E-mail：358595564@qq.com