楊翼，李章華，石武諦，柳華，張杰

熱預(yù)處理對(duì)超負(fù)荷訓(xùn)練大鼠心肌蛋白激酶C表達(dá)的影響①

楊翼1，李章華2，石武諦1，柳華1，張杰1

目的觀察熱預(yù)處理(HP)對(duì)超負(fù)荷訓(xùn)練大鼠心肌蛋白激酶C(PKC)δ、PKCε表達(dá)的影響。方法3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠25只分為對(duì)照組(n=5)、訓(xùn)練組(n=10)和HP組(n=10)。超負(fù)荷訓(xùn)練8周后應(yīng)用免疫組化法、Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)心肌組織PKCδ、PKCε表達(dá)。結(jié)果三種檢測(cè)方法均顯示，訓(xùn)練組大鼠心肌PKCδ表達(dá)較對(duì)照組和HP組增高(P＜0.05)。Real-time PCR與免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，訓(xùn)練組PKCε表達(dá)低于對(duì)照組和HP組(P＜0.05)；Western blotting結(jié)果顯示三組PKCε表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論在熱預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)中，PKC可能發(fā)揮了重要的作用。

熱預(yù)處理；心??；蛋白激酶C；過度運(yùn)動(dòng)；大鼠

[本文著錄格式]楊翼，李章華，石武諦，等.熱預(yù)處理對(duì)超負(fù)荷訓(xùn)練大鼠心肌蛋白激酶C表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):49-53.

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自1986年Murry等首次提出心臟預(yù)處理(preconditioning,PC)概念開始，眾多研究結(jié)果證實(shí)，心臟預(yù)處理能激活生物體自身內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生明顯的心臟保護(hù)效應(yīng)，使其可以對(duì)其后受到的較為嚴(yán)重的缺血、缺氧現(xiàn)象產(chǎn)生良好的耐受[1]。目前心臟預(yù)處理方法已經(jīng)從單一的缺血預(yù)處理發(fā)展到缺氧預(yù)處理、熱預(yù)處理、藥物預(yù)處理(包括中、西藥)、針灸預(yù)處理及電刺激預(yù)處理等多種形式，呈現(xiàn)出迅猛發(fā)展的態(tài)勢(shì)。熱預(yù)處理(heat preconditioning,HP)是近年發(fā)展起來的一種新型預(yù)處理方法。研究表明，適當(dāng)?shù)臒犷A(yù)處理可以有效調(diào)動(dòng)生物體的自我保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)，使心肌在隨后處于嚴(yán)重缺血、缺氧狀態(tài)時(shí)，仍然不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不可逆性心肌損傷，其作用可能涉及多種機(jī)制[2-5]。

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在心臟預(yù)處理發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的過程中起著關(guān)鍵作用，是多種因素作用的共同通路。目前發(fā)現(xiàn)的PKC家族至少有三大類十余種亞型，但并非所有種屬都擁有相同的PKC亞型，也不是所有的PKC亞型都參與預(yù)處理的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。PKCδ、PKCε是大鼠和人類共有的兩種PKC亞型。近年發(fā)現(xiàn)，它們與心臟預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)關(guān)系密切，在心肌缺血再灌注損傷過程中起著幾乎相反

的作用：PKCε激活可對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[6-7]，PKCδ激活則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引起細(xì)胞死亡[8-10]。在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，超負(fù)荷訓(xùn)練引起的心肌損傷與PKCδ、PKCε表達(dá)異常有關(guān)，它可能也是超負(fù)荷訓(xùn)練導(dǎo)致心肌損傷的作用機(jī)制之一[11]。而熱預(yù)處理可以調(diào)節(jié)心臟內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)分泌，調(diào)控心肌凋亡基因表達(dá)，預(yù)防心肌缺血局部的炎性反應(yīng)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷程度[12]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察熱預(yù)處理對(duì)超負(fù)荷訓(xùn)練大鼠心肌PKCδ、PKCε表達(dá)的影響，以了解熱預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性Sprague-Dauley大鼠25只，體質(zhì)量(200±20)g，3月齡，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK(鄂)2003-0004。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。動(dòng)物室溫度22～28℃，相對(duì)濕度50%～65%。分為A組(對(duì)照組，n=5)、B組(訓(xùn)練組，n=10)和C組(熱預(yù)處理組，n=10)。A組大鼠正常飼養(yǎng)，不予任何處理；B、C組大鼠均予以超負(fù)荷訓(xùn)練；C組大鼠在每周訓(xùn)練前行熱預(yù)處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

免疫組化試劑盒、DAB、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、二甲苯、無水乙醇、過氧化物酶阻斷劑、蘇木素復(fù)染液等試劑，Trizol、dNTPs(10 mmol/L)、隨機(jī)引物(25 pmol/μl)、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、ddH2O：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。TdT酶：PROMEGA公司。SYBR Green I：INVITROGEN公司。System 9600：PERKIN ELMER公司。PRISM 7700 Sequence Detector：ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超負(fù)荷訓(xùn)練

開始正式訓(xùn)練前，先讓大鼠適應(yīng)性游泳訓(xùn)練1周，在無負(fù)重的情況下每天游泳30 min。然后開始正式訓(xùn)練。正式訓(xùn)練第1周大鼠不負(fù)重，每天游泳120 min。正式訓(xùn)練第2周游泳時(shí)間維持120 min，在第1天和第2天，大鼠尾部負(fù)重其體重1%的砝碼；第3天和第4天，尾部負(fù)重其體重2%的砝碼；第5天和第6天，尾部負(fù)重其體重3%的砝碼。第3周游泳時(shí)間仍然為120 min，第1天和第2天，尾部負(fù)重其體重4%的砝碼；第3天和第4天，尾部負(fù)重為起體重5%的砝碼。然后在此負(fù)重下進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練。期間發(fā)現(xiàn)有力竭表現(xiàn)時(shí)(在水下10 s不能浮上)，撈上水面休息5 min后，繼續(xù)訓(xùn)練至滿120 min。這種訓(xùn)練模式一直持續(xù)到第7周。第8周每天上午和下午各進(jìn)行1次訓(xùn)練，每次120 min，負(fù)重其體重5%的砝碼。

1.3.2 熱預(yù)處理

C組動(dòng)物每周訓(xùn)練的前一天進(jìn)行熱預(yù)處理，恢復(fù)24 h后開始訓(xùn)練。大鼠麻醉后放在45℃恒溫箱中，直到大鼠直腸溫度達(dá)到(41.5±0.5)℃，持續(xù)15 min。室溫下恢復(fù)24 h。剔除死亡和精神萎靡的大鼠，剔除的大鼠及時(shí)補(bǔ)充。

1.4 免疫組化檢測(cè)

末次訓(xùn)練后24 h內(nèi)處死大鼠，取出心臟，矢狀位剖開，置4%多聚甲醛中固定48 h，梯度酒精脫水、包埋、切片、脫蠟，梯度酒精水化，按PKCδ、PKCε免疫組化試劑盒操作說明進(jìn)行免疫組化染色。心肌組織中出現(xiàn)黃染為陽(yáng)性。陰性對(duì)照用0.01 mol/L PBS代替一抗。采集圖像，IPP 6.0圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。選取5個(gè)待測(cè)區(qū)域，測(cè)定陽(yáng)性區(qū)域積分光密度(IOD)和總面積Area(Sum)，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域平均光密度(MOD)。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)

采用Trizol按試劑盒說明提取RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，電泳法檢測(cè)其完整性。

β-actin和PKCδ、PKCε引物序列和長(zhǎng)度如表1。引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列、長(zhǎng)度

逆轉(zhuǎn)錄體系：5×Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，RNA 3 μl，Oligo(dT)1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，ddH2O 10.5 μl，共20 μl。逆轉(zhuǎn)錄程序：42℃保溫60 min。95℃

5 min，4℃1～5 min，反應(yīng)產(chǎn)物迅速放入-20℃長(zhǎng)期凍存。

熒光定量PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，ddH2O 18 μl，dNTPs(10mmol/L)0.5 μl，F(xiàn)orward Primer(20 pmol/μl)2 μl，Reverse Primer(20 pmol/μl) 2 μl，Taq酶(2 U/μl)0.5 μl，SYBR Green I(10×)1 μl，Template cDNA 2 μl，共25 μl。β-actin反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2 min，變性94℃30 s，退火63℃30 s，延伸72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。PKCδ反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2 min，變性94℃30 s，退火64℃30 s，延伸72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。PKCε反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃2 min，變性94℃30 s，退火57℃30 s，延伸72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。

結(jié)果以2-ΔCt表示。

1.6 Western blotting

按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明提取蛋白并測(cè)定濃度。取蛋白80 μg沸水浴5 min后進(jìn)行電泳蛋白分離，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜。室溫下脫脂奶粉封閉2 h，加入用抗體稀釋液稀釋的β-actin(1∶1000)、PKCδ (1∶100)、PKCε(1∶100)抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST漂洗3次，加入二抗(1∶4000)，室溫?fù)u床上溫育1.5 h。TBST漂洗3次，ECL顯色，顯影定影。用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析，記錄目的蛋白與內(nèi)參蛋白比值。每組重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

A組PKCδ陽(yáng)性細(xì)胞極少，陽(yáng)性表達(dá)大多在胞漿中；B組和C組PKCδ在胞漿中和胞膜上均有表達(dá)，尤其是B組(圖1)。三組大鼠心肌PKCδ兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.05)。

B組心肌組織PKCε陽(yáng)性細(xì)胞極少，A組和C組PKCε在胞漿中和胞膜上均有陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。B組心肌PKCδ表達(dá)低于A和C組(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組心肌PKCδ、PKCε比較(MOD)

圖1 大鼠心肌PKCδ表達(dá)(免疫組化，400×)

圖2 大鼠心肌PKCε表達(dá)(免疫組化，400×)

2.2 Real-time PCR

B組心肌PKCδ mRNA表達(dá)顯著高于A組和C組(P＜0.001)，PKCε mRNA表達(dá)顯著低于A組和C組(P＜0.001)。見表3。

表3 兩組心肌PKCδ、PKCε mRNA比較(2-ΔCt)

2.3 Western blotting

B組PKCδ蛋白表達(dá)顯著高于A組和C組(P＜0.001)；心肌中PKCε蛋白表達(dá)三組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表4 兩組心肌PKCδ、PKCε Western blotting比較(/β-actin)

3 討論

保護(hù)運(yùn)動(dòng)員免在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中發(fā)生嚴(yán)重的損傷，是每個(gè)教練員和運(yùn)動(dòng)員必須解決的問題。運(yùn)動(dòng)員的訓(xùn)練時(shí)間越長(zhǎng)，這個(gè)問題越嚴(yán)重，解決起來就越困難。近年來，本課題組在系統(tǒng)研究了超負(fù)荷訓(xùn)練致心臟變化相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)上[11]，借鑒臨床心血管領(lǐng)域研究成果，將預(yù)處理方法引入運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，已初步取得一些的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[11-13]。

熱預(yù)處理是近年來發(fā)展較快的一種預(yù)處理方法。研究發(fā)現(xiàn)，熱預(yù)處理在提高機(jī)體耐受高溫能力的同時(shí)，也能提高機(jī)體對(duì)其他嚴(yán)重?fù)p傷的耐受能力，如延緩心肌壞死等[14-15]。其心肌保護(hù)作用體現(xiàn)在減少心肌梗死面積和增強(qiáng)心肌細(xì)胞存活力[16-17]、抗心律失常[18]、促進(jìn)心臟功能恢復(fù)等[14-15]。我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示，熱預(yù)處理可以通過調(diào)節(jié)心臟內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)分泌、調(diào)控心肌凋亡基因表達(dá)和預(yù)防心肌缺血局部的炎性反應(yīng)，從而抑制心肌細(xì)胞過度凋亡，減輕心肌損傷程度[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)熱預(yù)處理對(duì)超負(fù)荷訓(xùn)練后PKCδ、PKCε表達(dá)變化進(jìn)行研究，以深入了解熱預(yù)處理保護(hù)運(yùn)動(dòng)心臟的分子生物學(xué)機(jī)制。

PKC是1977年在鼠腦胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，由多種具有不同生物學(xué)特性的同工酶組成。它是一類結(jié)構(gòu)相似、功能不同的絲氨酸/蘇氨酸家族，廣泛存在于動(dòng)物的各種組織細(xì)胞中。研究證明，PKC是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，介導(dǎo)生物信號(hào)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核的傳遞，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞分化、增殖和凋亡起重要調(diào)節(jié)作用。

至今已在哺乳動(dòng)物的組織中確定了12種亞型，根據(jù)其結(jié)構(gòu)及特征分成3大類：①傳統(tǒng)PKC(conventional PKC,cPKC)，包括PKCα、PKCβ1、PKCβ2和PKCγ，需Ca2+和二脂酰甘油(diacyl glycerol,DAG)同時(shí)作用才被激活，因而也稱為鈣依賴型；②新型PKC (novel PKC,nPKC)，包括PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ，只需DAG即可被激活；③非典型PKC(atypical PKC,aPKC)，包括PKCζ、PKCλ和PKCι，不依賴于Ca2+和DAG激活，可被磷脂酰絲氨酸、3,4,5-三磷酸肌醇(inositol trisphosphate,IP3)與血管緊張素Ⅱ激

活[19]。

心肌組織中PKC表達(dá)存在種屬差異性，如成年大鼠心肌中表達(dá)8種PKC亞型，成年人心肌中可檢測(cè)到9種PKC亞型，而在人、兔、豚鼠、大鼠與小鼠心肌中均可以檢測(cè)到的只有PKCα、PKCδ和PKCε。心肌中表達(dá)PKC存在種屬差異性的生理學(xué)意義尚不清楚，但是，PKCα、PKCδ和PKCε在大部分種屬心肌內(nèi)表達(dá)，提示它們可能具有更重要的作用。

靜息狀態(tài)下，PKC主要存在于胞漿中，以鈍化形式存在。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的DAG濃度不足以活化PKC；當(dāng)受到外界信號(hào)刺激后，胞外信號(hào)通過受體激活磷脂酶C，通過磷脂酶-C和磷脂酶D使膜磷脂分解，產(chǎn)生3,4,5-IP3和DAG；3,4,5-IP3促使Ca2+池中的Ca2+釋出，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，激活PKC；而DAG可直接激活PKC。PKC被激活后，胞膜上ATP依賴的K離子通道(KATP)開放，K+外流，Ca2+內(nèi)流減少，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，ATP消耗減少，保護(hù)心肌細(xì)胞[20]。PKC激活后還可引起線粒體鈣負(fù)荷降低，減輕鈣負(fù)荷增加所致的心肌細(xì)胞凋亡[21]。在以前的研究中，我們?cè)^察到PKC途徑激活后具有保護(hù)心臟、增強(qiáng)抗疲勞能力的作用，從而預(yù)防心源性疲勞的發(fā)生和發(fā)展[22]。但這只是對(duì)整個(gè)PKC家族而言，具體到PKCδ、PKCε這些亞型與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的關(guān)系，及預(yù)處理對(duì)它們的影響

如何目前研究較少。

本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用免疫組化觀察PKCδ和PKCε表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]基本一致：熱預(yù)處理可抑制超負(fù)荷訓(xùn)練后PKCδ表達(dá)，而促進(jìn)PKCε表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，PKCδ表達(dá)變化幅度大于PKCε表達(dá)變化幅度，提示PKCδ對(duì)刺激的反應(yīng)較PKCε更為敏感，在超負(fù)荷訓(xùn)練致心肌損傷過程中可能更為重要。Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果大體與免疫組化的檢測(cè)結(jié)果相似。表明PKCδ、PKCε的激活與超負(fù)荷訓(xùn)練和熱預(yù)處理這兩種外界刺激因素有密切聯(lián)系。開發(fā)以PKCδ為靶點(diǎn)的治療方案可能是有益的。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)，在刺激因素作用下，PKCδ和PKCε的激活與PKC整個(gè)家族的激活可能不完全一致，PKC家族對(duì)外界刺激的反應(yīng)是各種亞型綜合作用的結(jié)果。在熱預(yù)處理發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的過程中，PKCδ和PKCε的表達(dá)均出現(xiàn)改變，提示它們?cè)谶@一過程中發(fā)揮了重要作用。比較而言，熱預(yù)處理對(duì)PKCδ的影響要大于對(duì)PKCε的影響。

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Effects of Heat Preconditioning on Expression of Protein Kinase C in Myocardium of Rats after Overload Exercise

YANG Yi,LI Zhang-hua,SHI Wu-di,LIU Hua,ZHANG Jie.College of Health Science,Wuhan Institute of Physical Education,Wuhan,Hubei 430079, China

Objective To investigate the effects of heat preconditioning(HP)on the expression of protein kinase C(PKC)δ and PKCε in the myocardium of overload exercise rats.Methods 25 male three-month-old Sprague-Dauley rats were divided into control group(n=5), exercise group(n=10)and HP group(n=10).The expression of PKCδ and PKCε in the myocardium was detected with immunohistochemistry,real-time PCR and Western blotting 8 weeks after overload exercise.Results The expression of PKCδ significantly increased in the exercise group compared with the control group and the HP group(P＜0.05).In another hand,PCR and immunohistochemistry showed the expression of PKCε in the exercise group decreased compared with the control group and the HP group(P＜0.05),but it was not significantly different among the groups using Western blotting(P＞0.05).Conclusion PKCs may play an important role in the HP-induced cardio-protection during overload exercise.

heat preconditioning;myocardium;protein kinase C;overload exercise;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.013

R873

A

1006-9771(2015)01-0049-05

2014-07-29

2014-11-26)

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30700388)；2.湖北省自然科學(xué)基金一般項(xiàng)目(No.2011CDB313)；3.湖北省教育廳科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No.D20144101)。

1.武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，湖北武漢市430079；2.武漢市第三醫(yī)院，湖北武漢市430060。作者簡(jiǎn)介：楊翼(1973-)，女，漢族，浙江余姚市人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。