吳羽楠，張?zhí)N，林如輝，陳立典，陶靜

電針對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及RhoA蛋白表達(dá)的影響①

吳羽楠1，張?zhí)N2，林如輝3，陳立典4，陶靜1

目的探討電針神庭、百會(huì)穴對腦缺血再灌注模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其可能機(jī)制。方法45只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。模型組和電針組均采用左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)再灌注模型。電針組電針神庭、百會(huì)穴共7 d。采用Morris水迷宮測試觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；尼氏染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；Western blotting法檢測大鼠左側(cè)海馬RhoA蛋白的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，電針組學(xué)習(xí)記憶能力改善(P＜0.05)，海馬神經(jīng)元損傷減少(P＜0.05)，海馬組織中RhoA蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。結(jié)論電針能夠改善腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與抑制RhoA蛋白表達(dá)有關(guān)。

腦缺血；電針；學(xué)習(xí)記憶；RhoA；大鼠

[本文著錄格式]吳羽楠，張?zhí)N，林如輝，等.電針對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及RhoA蛋白表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):17-21.

CITED AS:Wu YN,Zhang Y,Lin RH,et al.Effects of electroacupuncture on learning and memory ability and RhoA expression in rats after cerebral ischemic-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):17-21.

腦卒中是目前常見的導(dǎo)致死亡和殘疾的原因之一[1]。據(jù)調(diào)查，腦卒中后1個(gè)月內(nèi)，認(rèn)知功能障礙發(fā)生率約30%[2]，患者在康復(fù)治療中主動(dòng)配合能力嚴(yán)重受限，從而影響總體功能康復(fù)。針刺神庭、百會(huì)穴是治療認(rèn)知功能障礙行之有效的方法，但其機(jī)制尚不明確[3-5]。RhoA是Rho蛋白家族的主要成員，可與三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)結(jié)合參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RhoA蛋白活化可抑制軸突出芽、生長，縮短樹突長度[6-7]。研究表明，大鼠腦缺血后，缺血海馬CA1區(qū)RhoA表達(dá)升高，而抑制RhoA表達(dá)可明顯改善缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能[8]。本研究觀察電針神庭、百會(huì)穴對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及RhoA蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級雄性健康Sprague-Dawley大鼠45只，體質(zhì)

量(250±30)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號：SCXK(瀘)2012—0002。于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠編號，分為假手術(shù)組(n=15)、模型組(n= 15)、電針組(n=15)。實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照國際動(dòng)物保護(hù)和使用指南的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑和儀器

尼氏染色液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RhoA一抗：ABCAM公司。β-actin一抗、辣根過氧化物酶二抗：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。Image-lab圖像分析系統(tǒng)：BIO-RAD LABORATORIES公司。

1.3 模型制備

術(shù)前12 h大鼠禁食。參照改良Longa方法[9]制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型。大鼠稱重后10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉。頸前正中開口，充分暴露并鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及分叉處頸外動(dòng)脈，微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處附近剪一小口，將備好的栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入長度18.0～22.0 mm。撤去頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾，緩慢推動(dòng)栓線至大腦前動(dòng)脈近端。固定栓線，縫合傷口。2 h后回抽栓線至頸總動(dòng)脈分叉處，形成缺血再灌注模型。假手術(shù)組只分離動(dòng)脈，不結(jié)扎、插線。手術(shù)結(jié)束后，動(dòng)物放置于室溫(24℃)環(huán)境下蘇醒，正常喂養(yǎng)。

動(dòng)物蘇醒后按Longa評分判斷模型是否成功：0分，無神經(jīng)功能缺損體征；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。評分1～3分者納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組置于普通籠中飼養(yǎng)，予同等條件抓取。模型組造模后回籠飼養(yǎng)，予同等條件抓取。電針組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取大鼠神庭和百會(huì)穴，使用華佗牌30號0.5寸毫針，接G6805電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次，共7 d。于手術(shù)后第2天開始治療，直至動(dòng)物被處死。

1.5 Morris水迷宮測試

于術(shù)后3 d進(jìn)行。水迷宮水池圓桶形，直徑120 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(26±2)℃。池壁4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4個(gè)象限，池壁外標(biāo)4個(gè)入水點(diǎn)，任選一象限在其中央放置平臺(tái)。平臺(tái)直徑6 cm，高28 cm，沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。共訓(xùn)練4 d。

1.5.1 定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)

將大鼠按順時(shí)針方向依次由第1象限、第2象限、第3象限、第4象限入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中。如果大鼠在90 s內(nèi)爬上平臺(tái)，并停留3 s以上，則認(rèn)為大鼠找到平臺(tái)，記錄逃避潛伏期(escape latency)。如果90 s內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)，則拖拽其尾部，將其引導(dǎo)到平臺(tái)，停留10 s，潛伏期計(jì)為90 s。

1.5.2 空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe)

術(shù)后第7天，撤去平臺(tái)，取任意入水點(diǎn)將大鼠放入水中，觀察并記錄90 s內(nèi)大鼠穿過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。

1.6 取材及檢測

1.6.1 尼氏染色

麻醉下開胸，生理鹽水200 ml經(jīng)左心室快速?zèng)_洗，4%多聚甲醛(pH=7.4)400 ml灌流固定。取腦置4%多聚甲醛內(nèi)，4℃固定24～48 h。定位腦缺血區(qū)，常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，尼氏染色液染色，中性樹脂封片。光鏡下觀察左側(cè)大腦海馬組織CA1區(qū)和CA3區(qū)尼氏小體變化。于高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取2個(gè)視野，計(jì)數(shù)殘存的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

1.6.2 Western blotting

取左側(cè)海馬組織置液氮罐中速凍，-80℃冰箱保存。取海馬組織100 mg，加裂解緩沖液1 ml和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)10 μl，充分研磨后離心，取上清。BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取樣品蛋白50 μg，12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉液封閉2 h，分別用RhoA、β-actin一抗(1∶1000)孵育，4℃過夜，用辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均滿足方差齊性(P＞0.05)，以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試

隨著訓(xùn)練時(shí)間增加，各組大鼠逃避潛伏期呈逐漸縮短趨勢。從術(shù)后3 d起，與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)；與模型組相比，電針組逃避潛伏期時(shí)間縮短(P＜0.05)。術(shù)后7 d，模型組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)比假手術(shù)顯著減少(P＜0.001)，電針組比模型組增加(P＜0.05)。見表1。

2.2 尼氏染色

假手術(shù)組海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，核膜核仁清晰，大量活性神經(jīng)元存在。模型組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞大量丟失，殘存神經(jīng)元固縮破裂，排列疏松，核仁消失，出現(xiàn)空泡樣變。電針組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整性(圖1)。

與假手術(shù)組相比，模型組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元減少，電針組神經(jīng)元數(shù)比模型組增多(P＜0.05)。見表2。

2.3 Western blotting

與假手術(shù)相比，模型組海馬RhoA蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，電針組RhoA蛋白表達(dá)比模型組減少(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖1 各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元(尼氏染色,400×)

表2 各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)比較(/HD)

表3 各組大鼠海馬RhoA表達(dá)比較(/β-actin)

圖2 各組大鼠海馬組織RhoA蛋白表達(dá)

3 討論

督脈屬于奇經(jīng)八脈之一，上至風(fēng)府，入屬于腦，總督一身之陽脈，是“陽脈之海”，歷代醫(yī)家素有“病變在腦，首取督脈”之說。神庭穴為督脈、足太陽、陽明之會(huì)；百會(huì)穴為督脈、足太陽之會(huì)。神庭、百會(huì)穴主要用于治療心神病癥。

海馬區(qū)域是重要的學(xué)習(xí)與記憶的存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)[10-11]。腦缺血后會(huì)腦萎縮、皮質(zhì)變薄，神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病理性變化，當(dāng)這些病理改變發(fā)生在海馬等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。

Morris水迷宮是用于嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能評估的重要工具，由英國生理學(xué)家Morris設(shè)計(jì)，目前已成為一種研究空間學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)工具。本研究采用Morris水迷宮初步證實(shí)電針神庭、百會(huì)可以明顯提高腦缺血再灌注損傷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。同時(shí)觀察到，電針可以減輕腦缺血再灌注對大鼠海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。

Rho家族蛋白是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重要調(diào)節(jié)子，可以將胞外的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)，在神經(jīng)元的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，包括軸突的生長和延伸，樹突棘的形成和維持[13]。RhoA是Rho家族Rho亞族中的成員。RhoA激活可以抑制軸突出芽和生長，其細(xì)胞內(nèi)信號傳遞可能機(jī)制為髓鞘抑制因子Nogo-A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte/myelin glycoprotein,OMGP)的激活，作用于Nogo-66受體(NgR)，激活RhoA，通過其下游Rho激酶調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的活動(dòng)，繼而引起軸突生長錐的崩潰[14-16]。同時(shí)，活性RhoA可以縮短樹突的長度，其可能機(jī)制為RhoA可以激活下游Rho激酶，Rho激酶直接引起肌球蛋白輕鏈(myosinlight chain,MLC)磷酸化，形成磷酸化MLC(myosinlight chain phosphatase, MLCP)，并最終導(dǎo)致肌球蛋白回縮[17-18]。

突觸的可塑性是突觸發(fā)育及神經(jīng)通路重塑的先決條件，也是學(xué)習(xí)和記憶的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[19]。大鼠腦缺血再灌注后，缺血區(qū)周圍腦組織RhoA表達(dá)升高，抑制RhoA可明顯改善缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。推測RhoA在腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)中起著重要作用。本研究中，電針組RhoA蛋白表達(dá)減少與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化一致，提示電針促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的恢復(fù)可能通過調(diào)節(jié)RhoA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，電針神庭、百會(huì)能夠改善腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)理可能與電針治療能夠抑制腦缺血再灌注大鼠海馬RhoA蛋白的表達(dá)以及其對腦缺血再灌注大鼠海馬的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

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Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability and RhoA expression in Rats after Cerebral Ischemic-reperfusion

WU Yu-nan,ZHANG Yun,LIN Ru-hui,CHEN Li-dian,TAO Jing.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350108,China

Objective To explore the effects of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on learning and memory ability in the cerebral ischemia-reperfusion rats and its possible mechanism.Methods 45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=15),ischemia group(n=15)and electroacupuncture group(n=15).The latter 2 groups were modeled as focal cerebral ischemia-reperfusion injury,and the electroacupuncture group received electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)for 7 days. They were tested with Morris Water Maze,observed with Nissl's staining.The protein expression of RhoA was detected with Western blotting.Results The learning and memory ability improved in the electroacupuncture group(P＜0.05),the injury of the neurons reduced(P＜0.05)and the expression of RhoA in hippocampus decreased compared with the ischemia group(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture could ameliorate the learning and memory ability in ischemia-reperfusion rats,which may relate with the inhibition of the expression of RhoAin hippocampus.

electrocerebral ischemia;acupuncture;learning and memory;RhoA;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.005

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0017-05

2014-09-18

2014-11-06)

福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(No.X2012004-協(xié)同)。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350108；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州市350108；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350108。作者簡介：吳羽楠(1989-)，女，漢族，福建福州市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)治療。通訊作者：陶靜(1977-)，女，漢族，江蘇淮安市人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：腦血管病的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)治療。E-mail:taojing01@163.com。