張蕊，范思遠(yuǎn)，梁珍，紀(jì)超，楊楠，劉雁勇，崔麗英，左萍萍

谷紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的影響①

張蕊1，范思遠(yuǎn)2，梁珍1，紀(jì)超1，楊楠1，劉雁勇1，崔麗英2，左萍萍1

目的觀察谷紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的影響。方法Sprague-Dawley大鼠90只分為假手術(shù)組、模型組、乙酰谷酰胺組、紅花注射液組和谷紅注射液組，采用大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)建立腦缺血2 h再灌注損傷模型。術(shù)后24 h給藥治療，連續(xù)給藥14 d。采用Bederson神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分平衡桿測(cè)試觀察各組運(yùn)動(dòng)功能。酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色觀察各組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活率。結(jié)果模型組大鼠的過(guò)桿總時(shí)間比假手術(shù)組明顯增加(P＜0.01)，紅花注射液與谷紅注射液組過(guò)桿總時(shí)間較模型組降低(P＜0.05)。模型組大鼠缺血側(cè)黑質(zhì)TH神經(jīng)元細(xì)胞存活率較健側(cè)顯著減少(P＜0.001)，紅花注射液和谷紅注射液組TH神經(jīng)元的細(xì)胞存活率較模型組明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論谷紅注射液能顯著改善腦缺血再灌注大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙，其保護(hù)作用可能與抑制黑質(zhì)神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷有關(guān)。

腦缺血再灌注；谷紅注射液；運(yùn)動(dòng)功能；黑質(zhì)；酪氨酸羥化酶

[本文著錄格式]張蕊，范思遠(yuǎn)，梁珍，等.谷紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):12-16.

CITED AS:Zhang R,Fan SY,Liang Z,et al.Effects of Guhong Injection on motor dysfunction in cerebral ischemia-reperfusion rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):12-16.

腦卒中是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的腦血管疾病，致殘致死率極高[1]，其中約80%為缺血性腦卒中[2]。目前臨床上治療腦缺血主要采用梗死發(fā)生后的極早期進(jìn)行溶解血栓、恢復(fù)血流，但是由于溶栓藥組織型纖溶酶原激活物(tPA)的治療時(shí)間窗很窄，限制了其應(yīng)用。

腦缺血損傷是一個(gè)可引起一系列復(fù)雜反應(yīng)的過(guò)程，迫切需要多種作用機(jī)制的治療藥物[3]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)引起黑質(zhì)遠(yuǎn)隔區(qū)繼發(fā)性損傷可能是腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)不理想的重要原因[4]。而酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是黑質(zhì)合成多巴胺的標(biāo)志酶。

谷紅注射液為中西藥復(fù)方制劑，為乙酰谷酰胺和中藥紅花提取物制成的滅菌水溶液，其治療急性缺血性腦卒中的有效性得到大量臨床試驗(yàn)證實(shí)[5-14]。本實(shí)驗(yàn)采用線(xiàn)栓法建立大鼠MCAO模型，從整體水平上觀察

谷紅注射液對(duì)神經(jīng)功能障礙的影響，并探討其作用機(jī)制是否與保護(hù)遠(yuǎn)隔區(qū)黑質(zhì)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

谷紅注射液(批號(hào)S201212111)、紅花注射液(批號(hào)S201212112)、乙酰谷酰胺注射液(批號(hào)S201212113)：通化谷紅制藥有限公司。生理鹽水：石家莊四藥有限公司。尼龍栓線(xiàn)：北京沙東生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)2634-100。兔抗TH多克隆抗體：MILLIPORE公司，貨號(hào)AB152。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗檢測(cè)試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)PV-9001。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley大鼠90只，雄性，體質(zhì)量(180± 20)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，12 h周期明暗，自由進(jìn)食與進(jìn)水。室溫保持20～25℃。

1.3 模型制備

參照Longa法復(fù)制MCAO模型[15]，并加以改進(jìn)。大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后進(jìn)行手術(shù)。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則給予人道關(guān)懷。術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于平板上，碘伏消毒。頸正中行長(zhǎng)約2 cm切口。鈍性分離肌肉，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。分離血管與神經(jīng)。用手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈主干近心端，徹底阻斷其血流。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)關(guān)閉頸總動(dòng)脈分叉處近端，在頸總動(dòng)脈近分叉處預(yù)先放置好一根手術(shù)線(xiàn)，然后用眼科剪在頸總動(dòng)脈近分叉處剪一切口(切口與分叉處距離4～5 mm)，從切口處插入釣魚(yú)線(xiàn)。魚(yú)線(xiàn)在血管中前進(jìn)約18～20 mm后固定。2 h后再麻醉大鼠，拔出魚(yú)線(xiàn)。

假手術(shù)組只分離血管不插魚(yú)線(xiàn)。

1.4 分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠隨機(jī)分為以下5組：A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(乙酰谷酰胺注射液治療組)、D組(紅花注射液治療組)、E組(谷紅注射液治療組)。各組死亡大鼠不予補(bǔ)充。

術(shù)后24 h開(kāi)始藥物干預(yù)。A組和B組腹腔注射生理鹽水1 ml/100 g，C組腹腔注射30 mg/ml乙酰谷酰胺1 ml/100 g，D組腹腔注射0.5 g/ml紅花注射液1 ml/100 g，E組腹腔注射谷紅注射液(紅花0.5 g/ml，乙酰谷酰胺30 mg/ml)1 ml/100 g。每天1次，連續(xù)14 d。定期測(cè)量大鼠體重并根據(jù)體重調(diào)整注射劑量。

1.5 神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分

術(shù)后1 d、7 d和14 d(處死前)行Bederson神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分。提鼠尾使大鼠離開(kāi)地面約30 cm，觀察雙側(cè)前肢情況；將大鼠置于水平地面，從兩側(cè)推動(dòng)其雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力有無(wú)差異；大鼠置于地面，觀察其自由行走情況。0分，無(wú)神經(jīng)缺損癥；1分，輕度神經(jīng)缺損癥狀(提尾時(shí)癱側(cè)前肢內(nèi)收，不能全伸直)；2分，中度神經(jīng)缺損癥狀(行走時(shí)向癱側(cè)傾倒)；3分，重度神經(jīng)缺損癥狀(向癱側(cè)旋轉(zhuǎn))。

1.6 平衡桿測(cè)試

給藥14 d后開(kāi)始測(cè)試。平衡桿為長(zhǎng)105 cm，寬4 cm，厚3 cm的木桿。木桿離地80 cm，兩端由木架支撐。木桿一端為起始區(qū)，長(zhǎng)20 cm，另一端為終點(diǎn)區(qū)，終點(diǎn)區(qū)后接一個(gè)大鼠籠。平衡桿正下方放置約厚10 cm木屑?jí)|料，以防大鼠跌傷。測(cè)試時(shí)，大鼠放在起始區(qū)，面對(duì)鼠籠，開(kāi)始計(jì)時(shí)。記錄大鼠四肢均通過(guò)起始區(qū)(過(guò)桿潛伏期)和整個(gè)平衡桿(過(guò)桿總時(shí)間)的時(shí)間。潛伏期最大允許時(shí)間為1 min，過(guò)桿總時(shí)間為2 min[16]。測(cè)試前所有大鼠每天訓(xùn)練1次，共訓(xùn)練2 d，于第3天正式測(cè)試。

1.7 TH免疫組化染色

行為學(xué)評(píng)價(jià)后，每組取3只大鼠戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，剪開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，從左心尖處插入灌流針，剪開(kāi)右心耳。先用PBS進(jìn)行灌流，待血液沖洗干凈后改用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流約15 min。斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4℃過(guò)夜固定。固定1周后，轉(zhuǎn)入15%、20%和30%蔗糖溶液中梯度脫水，4℃放存。冰凍切片機(jī)切取冠狀腦片，片厚30 μm，收集于凍存液中，-20℃保存。挑取黑質(zhì)部位的腦片進(jìn)行TH免疫組化染色。染色嚴(yán)格按照SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。一抗為兔抗大鼠多克隆TH抗體(1∶800)，DAB染色、干燥封片，20×顯微鏡下觀察，每只大鼠取3張腦片，分別計(jì)數(shù)左(正常側(cè))、右(缺血側(cè))兩側(cè)大腦黑質(zhì)區(qū)各3個(gè)視野存活TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算存活率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。計(jì)量資料以(±s)表示。Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗(yàn)，Levene法行方差齊性檢驗(yàn)。滿(mǎn)足正態(tài)性或方差齊性，采用單因素方差分析；若不滿(mǎn)足正態(tài)性或方差齊性，則使用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。單因素方差分析存

在顯著性差異時(shí)，使用最小顯著差法(Least Significance Difference,LSD)進(jìn)行Post hoc檢驗(yàn)。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)存在顯著性差異時(shí)，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行Post hoc檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將各組拆分成兩種不同組合，分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。組合1：A組和B組，驗(yàn)證是否造模成功。組合2：B組、C組、D組和E組，比較不同藥物干預(yù)的效果是否有差異。若組合2有顯著性差異，再進(jìn)行Post hoc檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)顯示，術(shù)后1 d、7 d、14 d，組合1神經(jīng)功能缺損評(píng)分有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，組合2無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2 平衡桿測(cè)試

Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)顯示，組合1過(guò)桿總時(shí)間有高度顯著性差異(P＜0.01)，組合2有高度顯著性差異(P＜0.01)，其中，B組、D組與E組間有高度顯著性差異(χ2=10.786,P=0.005)。Post hoc檢驗(yàn)顯示，D組(U= 10.500,P=0.003)、E組(U=11.500,P=0.010)與B組間有顯著性差異。見(jiàn)表2。過(guò)桿潛伏期無(wú)顯著性差異。

2.3 黑質(zhì)區(qū)TH免疫組化染色

單因素方差分析顯示，組合1細(xì)胞存活率有非常高度顯著性差異(F=15.648,P＜0.001)。組合2有高度顯著性差異(P＜0.01)。與B組比較，D組和E組存活率均增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

表2 各組平衡桿測(cè)試過(guò)桿總時(shí)間比較(s)

圖1 各組黑質(zhì)部位TH陽(yáng)性細(xì)胞存活率

3 討論

當(dāng)前，缺血性腦血管疾病發(fā)病率逐年增高，病死率達(dá)60%～80%；即使存活，也留有嚴(yán)重后遺癥。腦梗死患者會(huì)出現(xiàn)偏癱、共濟(jì)失調(diào)等肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙，給患者的生活帶來(lái)嚴(yán)重困擾[17]。改善腦缺血損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)功能障礙對(duì)于腦卒中患者的預(yù)后和功能恢復(fù)至關(guān)重要。

在臨床實(shí)踐中，紅花的安全性基本得到認(rèn)可。乙酰谷酰胺是一種神經(jīng)肽，可以透過(guò)血腦屏障，加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)谷光甘肽合成，具有潛在的抗氧化損傷功能[18]。谷紅是紅花和乙酰谷酰胺的混合物，根據(jù)這兩種成分的特性，我們推測(cè)谷紅可能具有提高腦組織抵抗腦缺血的能力。本研究顯示，谷紅注射液治療可改善平衡桿測(cè)試的運(yùn)動(dòng)功能。

已有的報(bào)道顯示，采用大鼠MCAO模型不僅造成損傷側(cè)大腦皮質(zhì)、尾殼核和豆?fàn)詈巳毖Ｋ溃疫h(yuǎn)離梗死灶，但與之有大量纖維聯(lián)系的黑質(zhì)區(qū)域也相繼發(fā)生退行性改變，與最終運(yùn)動(dòng)功能障礙密切相關(guān)[19-20]。隨著神經(jīng)影像技術(shù)的廣泛運(yùn)用，臨床上也觀察到患者中動(dòng)脈梗阻或蒼白球受損都會(huì)導(dǎo)致同側(cè)黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元發(fā)生繼發(fā)性病變[21-23]。減少黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性損傷在腦缺血治療中具有重要意義。

我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中觀察到，經(jīng)谷紅注射液治療后，大鼠腦組織Caspase-3表達(dá)明顯下降，推測(cè)其抗急性腦缺血的作用可能與抗凋亡有關(guān)[18]。本研究觀察到，谷紅注射液對(duì)腦缺血后遠(yuǎn)隔區(qū)黑質(zhì)繼發(fā)性損害有保護(hù)作用。黑質(zhì)-紋狀體通路是調(diào)控肢體運(yùn)動(dòng)的重要中樞，谷紅注射液改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙可能與保護(hù)黑質(zhì)神經(jīng)元有關(guān)。需要說(shuō)明的是，由于我們給藥時(shí)間較長(zhǎng)，過(guò)程中缺血側(cè)紋狀體出現(xiàn)了液化壞死，故未能對(duì)其進(jìn)行切片染色。

隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加速，腦血管病已成為危害人類(lèi)健康和生命的主要疾患。抗腦缺血藥物研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的研究熱點(diǎn)。臨床顯示谷紅注射液作為有效的抗腦缺血藥物，安全性較高，通過(guò)對(duì)其作用機(jī)制的深入探討，將會(huì)開(kāi)辟出谷紅注射液更廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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Effects of Guhong Injection on Motor Dysfunction in Cerebral Ischemia-reperfusion Rats

ZHANG Rui,FAN Si-yuan,LIANG Zhen, JI Chao,YANG Nan,LIU Yan-yong,CUI Li-ying,ZUO Ping-ping.Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,China

Objective To evaluate the effects of Guhong Injection on motor dysfunction in rats after cerebral ischemia-reperfusion. Methods The middle cerebral arteries were occluded for 2 hours and re-perfused in Sprague-Dawley rats.They were divided in sham group, model group,Aceglutamide group,Safflowere group and Guhong group,which were intravenously administrated with normal saline,Aceglutamide,Safflower or Guhong 24 hours after operation,and continued for 14 days.They were tested with the beam-walking test after treatment.Tyrosine hydroxylase(TH)immunohistochemical staining was used to investigate the viability of neurons in the substantia nigra.Results The model group spent more time in the beam-walking test than that in the sham group(P＜0.01),and it decreased in the Safflower group and Guhong group compared with that in the model group(P＜0.05).The TH-positive neurons decreased in the model rat compared with that in the sham group(P＜0.001),and increased in both Safflower and Guhong groups compared with that in the model group(P＜0.01).Conclusion Guhong administration could significantly improve the motor dysfunction in rats after cerebral ischemia-reperfusion, which might be related to provent the neurons from injury in the substantia nigra.

cerebral ischemia-reperfusion;Guhong Injection;motor dysfunction;substantia nigra;tyrosine hydroxylase

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.004

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0012-05

2014-11-24

2015-01-05)

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81100801)；2.菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司項(xiàng)目。

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，北京市100005；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院，北京市100005。作者簡(jiǎn)介：張蕊(1986-)，女，陜西渭南市人，博士研究生，主要研究方向：腦血管病與神經(jīng)藥理學(xué)。通訊作者：左萍萍。E-mail:pingping_zuo@126.com。