翟 琨，王聯(lián)芝，向東山,*

（1.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

雙色熒光定量檢測大米中的汞

翟 琨1,2，王聯(lián)芝2，向東山1,2,*

（1.湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

利用兩條部分互補的富含胸腺嘧啶（T堿基）的單鏈核酸，結(jié)合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，采用同步熒光分析法，建立一種高靈敏度、高選擇性的汞離子（Hg2+）雙色熒光定量檢測方法。在優(yōu)化條件下，Hg2+濃度在5×10—10～500×10—10mol/L之間時，SYBR GreenⅠ及Carboxy-X-rhodamine（ROX）總的熒光強度（ΔIT）與Hg2+濃度（C）之間具有良好的線性關(guān)系，其擬合的回歸方程為?IT= 2.121 3C+10.536 0，方法檢出限（3σ）為2×10—10mol/L。該方法操作簡單、檢測速度快、選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好、檢出限低。將該方法應(yīng)用于大米中汞的檢測，獲得了滿意的結(jié)果。

汞；定量檢測；雙色熒光；大米

汞是一種對人體健康有嚴(yán)重危害的金屬元素，在人體中具有累積效應(yīng)[1-2]。汞攝入量過多會影響人體的生殖和發(fā)育，有致畸、致癌、致突變作用，嚴(yán)重的還會產(chǎn)生精神異常，極大地危害人體健康[3-7]。因此，汞的定量檢測在食品領(lǐng)域中具有十分重要的意義。

目前，汞常用的定量檢測方法有紫外-可見光分光光度法[8]、原子發(fā)射光譜法[9]、原子吸收分光光度法[10]、原子熒光法[11]、高效液相色譜法[12]及電感耦合等離子體質(zhì)譜法[13]等。在這些分析方法中，紫外-可見光分光光度法實驗設(shè)備簡單、檢測方便且具有較高的檢測靈敏度，但該方法顯色反應(yīng)時間長，汞離子顯色劑的特異性不高，樣品中存在與汞離子化學(xué)性質(zhì)相近的重金屬離子時誤差較大；原子發(fā)射光譜法具有較好的選擇性，較低的檢出限、極小的基體效應(yīng)、較高的精密度及廣泛的測量范圍等特點，但對儀器和精度要求較高，設(shè)備造價昂貴，而且不能進(jìn)行即時測量；原子吸收分光光度法是目前最常用的汞的檢測方法，特別是冷原子吸收法現(xiàn)已成為國家標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法對樣品制備要求較高，所用時間長，對設(shè)備要求較高；原子熒光法具有譜線簡單、靈敏度高、干擾少、檢出限低等優(yōu)點，但檢測時產(chǎn)生汞蒸氣，對操作人員的健康具有一定的威脅；高效液相色譜法及電感耦合等離子體質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性好的特點，但所需儀器價格昂貴，在多數(shù)實驗室中的推廣應(yīng)用受到限制。

氧化石墨烯是一種性能優(yōu)異的新型碳材料，比表面積較大，且表面具有豐富的官能團(tuán)[14-16]。研究表明，氧化石墨烯對單鏈核酸具有很強的吸附能力，但對雙鏈核酸的吸附能力很弱[17-18]。另外，氧化石墨烯對熒光染料具有極高的猝滅作用，且猝滅范圍很廣[19-20]。

核酸染料SYBR GreenⅠ是一種不對稱的菁類核酸染料，它本身的熒光信號很弱，與單鏈DNA也幾乎不發(fā)生作用，但它與雙鏈DNA有很強的親和性，且與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光強度會增加800～1 000 倍，是目前所發(fā)現(xiàn)的最靈敏的核酸染料之一[21]。

基于此，本實驗利用T堿基與Hg2+能特異性結(jié)合形成穩(wěn)定“T-Hg2+-T”結(jié)構(gòu)的特點[22]，設(shè)計了兩條部分互補的富含T堿基的單鏈DNA（其中一條用熒光染料Carboxy-X-rhodamine（ROX）標(biāo)記），并結(jié)合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，建立了一種高靈敏的Hg2+雙色熒光定量檢測方法，并將其應(yīng)用于大米分析中。

與以前報道的分析方法相比，這種方法不僅具有很高的選擇性，而且可以顯著地提高檢測的靈敏度，降低Hg2+的檢出限。該方法操作簡單、檢測速度快、選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好、檢出限低。將該方法應(yīng)用于大米中汞的檢測，獲得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米 益海糧油工業(yè)有限公司。

氧化石墨烯 中科碳納米科技有限公司；SYBR Green Ⅰ購于上海瑞安生物技術(shù)有限公司，原始溶液為無水二甲基亞砜制備的10 000倍濃縮液，工作液是濃縮液用超純水1∶10 000稀釋得到；Hg(NO3)2及其他所有化學(xué)試劑均為分析純均購自美國Sigma公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl緩沖溶液由0.1 mol/L Tris通過0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)得到。兩種單鏈核酸均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（中國）合成并用高效液相色譜法進(jìn)行純化，其核苷酸序列如下：核酸序列Ⅰ（P1）：5’- CTG CTT GCT C -3’；核酸序列Ⅱ（C1）：5’-GAG CTT GCT G-(CH2)6-ROX-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301PC型熒光光譜儀、PB-21型pH計 日本Shimadzu公司；AFS-922型原子熒光光度計 北京吉天儀器有限公司；Ethos Plus型微波消解系統(tǒng) 意大利Milestone公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將兩種富含T堿基的單鏈核酸分別溶解在Tris-HCl緩沖溶液中，并配制成5×10—7mol/L的溶液。取50 μL 5×10—7mol/L的P1溶液加入到50 μL 5× 10—7mol/L的C1溶液中并混合均勻，再加入50 μL不同濃度的Hg(NO3)2溶液，并加入緩沖溶液至總體積達(dá)到390 μL，在35 ℃孵育10 min后，冷卻至室溫，加入100 μL SYBR GreenⅠ工作液并在室溫條件下反應(yīng)10 min后，再加入10 μL 0.5 mg/mL的氧化石墨烯，孵育3 min，最后對ROX及SYBR GreenⅠ的熒光信號進(jìn)行檢測。在條件優(yōu)化時，兩種單鏈核酸的濃度均為5× 10—8mol/L，Hg2+的濃度為5×10—8mol/L，兩種單鏈DNA與Hg2+孵育溫度為35 ℃，孵育時間為10 min。

大米樣品的消化條件：準(zhǔn)確稱取0.50 g樣品，置于聚四氟乙烯的消解罐中，加人6 mL硝酸和4 mL雙氧水（H2O2），密封后將消解罐放入微波中加熱，升溫程序為100 ℃保持30 min，140 ℃保持25 min，180 ℃保持25 min，樣品消解完全后自然冷至室溫。將樣品消解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用1%的硝酸溶液定容，搖勻待測。

1.3.2 Hg2+的檢測

Hg2+的測定通過對ROX及SYBR GreenⅠ熒光信號的檢測實現(xiàn)。SYBR GreenⅠ最大激發(fā)波長為499 nm，最大發(fā)射波長為523 nm，波長間隔（Δλ）為24 nm；ROX的最大激發(fā)波長為588 nm，最大發(fā)射波長為610 nm，Δλ為22 nm。這兩種染料的波長間隔較小，但很接近，為了消除反射及瑞利散射對熒光信號的干擾，采用同步掃描熒光光譜法進(jìn)行分析。該實驗中同步掃描的波長間隔設(shè)置為23 nm，熒光分光光度計的激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為10 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

利用兩條部分互補的富含T堿基的單鏈DNA（其中一條用熒光染料ROX標(biāo)記）、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）及核酸染料SYBR GreenⅠ對Hg2+檢測的原理如圖1所示。在沒有Hg2+時，兩條單鏈核酸中有多個T-T錯配堿基，不能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，核酸染料SYBR GreenⅠ與核酸的作用很微弱，其熒光信號很弱。當(dāng)加入氧化石墨烯時，兩種單鏈DNA均被氧化石墨烯吸附，熒光染料ROX的熒光被猝滅，熒光信號也很弱。在有Hg2+時，兩條單鏈核酸通過“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，與SYBR GreenⅠ的作用增強，SYBR GreenⅠ的熒光信號顯著增強；當(dāng)加入氧化石墨烯時，雙鏈核酸不能被氧化石墨烯吸附，ROX的熒光不能被猝滅，因此其熒光信號也會顯著增強。利用Hg2+存在時，SYBR GreenⅠ及ROX的熒光信號都顯著增強的原理，即可實現(xiàn)Hg2+的雙色熒光定量檢測。

圖 1 檢測原理圖Fig.1 Mechanism for mercury detection

2.2 方法可行性分析

Hg2+濃度不同時SYBR GreenⅠ及ROX所對應(yīng)的同步掃描熒光光譜見圖2。在沒有Hg2+存在時，SYBR GreenⅠ及ROX的熒光信號都很弱（圖2a）；當(dāng)溶液中加入Hg2+后，SYBR GreenⅠ及ROX的熒光信號都顯著增強，且Hg2+濃度不同時，它們所對應(yīng)的熒光信號都有顯著的區(qū)別（圖2b、c）。由此說明，利用上述原理對Hg2+的雙色定量檢測是可行的。

圖 2 Hg 2 Hg2+濃度不同時SYBR GreenⅠ（左）及ROX（右）X對應(yīng)的同步掃描光譜圖Fig.2 Synchronous scanning fluorescence spectra of SYBR GreenⅠ(left) and ROX (right) for different concentrations of Hg2＋

2.3 pH值對測定結(jié)果的影響

圖 3 pH值對熒光強度的影響Fig.3 Effect of pH on the fl uorescence intensity

緩沖溶液的pH值可以影響兩種單鏈DNA與Hg2+形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，也可以直接影響核酸染料SYBR GreenⅠ及熒光染料ROX的熒光強度。本實驗以Tris-HCl作為緩沖溶液，考察不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖3）表明，在pH值為7.0～9.0的范圍內(nèi)，兩種熒光染料的熒光強度都是先增加，然后又降低。在pH值等于8.2時效果最好，因此本實驗選擇緩沖溶液的pH值為8.2。

2.4 反應(yīng)溫度對測定結(jié)果的影響

反應(yīng)溫度是影響兩種單鏈DNA與Hg2+形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的重要因素之一，溫度太低，反應(yīng)速度慢，而反應(yīng)溫度超過雙鏈的解旋溫度，雙螺旋結(jié)構(gòu)則不能形成。本實驗對不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行考察。結(jié)果（圖4）表明，反應(yīng)溫度在25～35 ℃之間時，SYBR GreenⅠ及ROX的熒光強度都隨著溫度的升高而增加；當(dāng)溫度超過35 ℃后，兩種染料的熒光強度均快速下降。這主要是因為本實驗所設(shè)計的兩種單鏈與Hg2+形成的雙鏈解旋溫度在38 ℃左右，當(dāng)溫度超過35 ℃后，有部分雙鏈發(fā)生解旋形成單鏈所造成的。因此，本實驗選擇的最佳反應(yīng)溫度為35 ℃。

圖 4 反應(yīng)溫度對熒光強度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the fl uorescence intensity

2.5 反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響

反應(yīng)時間也是影響兩種單鏈DNA與Hg2+形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的重要因素之一，本實驗對不同的反應(yīng)時間進(jìn)行考察。結(jié)果（圖5）表明，反應(yīng)時間在2～10 min內(nèi)，SYBR GreenⅠ及ROX的熒光強度均隨著反應(yīng)時間的延長而增加，當(dāng)反應(yīng)時間超過10 min時，熒光強度趨于穩(wěn)定，說明反應(yīng)在10 min內(nèi)即可完成。因此，本實驗選擇的反應(yīng)時間為10 min。

圖 5 反應(yīng)時間對熒光強度的影響Fig.5 Effect of reaction time on the fl uorescence intensity

2.6 離子強度對測定結(jié)果的影響

離子具有穩(wěn)定雙鏈DNA的作用。本實驗通過加入不同濃度的NaCl考察離子強度對熒光強度的影響。結(jié)果（圖6）表明，NaCl濃度在0～20 mmol/L之間時，SYBR GreenⅠ及ROX的熒光強度均隨著NaCl濃度的增加而增加。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到20 mmol/L后，其熒光強度趨于穩(wěn)定。本實驗選擇NaCl濃度為20 mmol/L。2.7 工作曲線及檢出限

圖 6 離子強度對熒光強度的影響Fig.6 Effect of ionic strength on the fl uorescence intensity

在最優(yōu)實驗條件下，對Hg2+的濃度與相應(yīng)SYBR GreenⅠ及ROX的熒光強度之間的關(guān)系進(jìn)行考察。結(jié)果（圖7）表明，在Hg2+濃度為5×10—10～500× 10—10mol/L之間時，SYBR GreenⅠ及ROX總的熒光強度?IT（ΔIT=ΔI1+ΔI2，I1為SYBR GreenⅠ的熒光強度，I2為ROX的熒光強度；ΔI = I—I0，I0和I分別表示有Hg2+和沒有Hg2+時的熒光強度）與Hg2+濃度（C）之間具有良好的線性關(guān)系。其擬合的回歸方程為ΔIT= 2.121 3C+ 10.536 0（R2= 0.998 6）。對9 個濃度為5×10—9mol/L 的平行樣品分別進(jìn)行檢測以評價方法的精密度，9個檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.43%，說明方法具有良好的精密度。用空白試劑標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=11）的3倍除以回歸方程的斜率得方法的檢出限為2×10—10mol/L。

圖 7 工作曲線Fig.7 Calibration curve

2.8 干擾實驗

按照檢測Hg2+的實驗方法，考察大米中常見的金屬離子Ca（Ⅱ）、Mg（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Al（Ⅲ）、K（Ⅰ）、Na（Ⅰ）、Ni（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）及Cr（Ⅲ）對Hg2+測定的干擾。結(jié)果（圖8）表明，在其他金屬離子濃度為Hg2+濃度100倍的情況下（Hg2+的濃度為5×10—8mol/L，其他金屬離子的濃度為5×10—6mol/L），Hg2+所對應(yīng)的兩種熒光染料的熒光強度還是遠(yuǎn)大于其他金屬離子，這表明該方法對大米中Hg2+的檢測具有很高的選擇性。2.9 與原子熒光法測定結(jié)果的比較及其應(yīng)用

在不含Hg2+的大米中加入已知量的Hg(NO3)2，樣品經(jīng)消化后分別用本方法和原子熒光法測定Hg2+的含量，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯觯? 種方法測定結(jié)果基本相同。本方法應(yīng)用于加入大米中Hg(NO3)2的檢測，結(jié)果如表2所示。由表2可知，在本實驗所使用的大米中未檢測出Hg2+，該檢測方法用于加入大米Hg(NO3)2的檢測可獲得較為滿意的結(jié)果。

表 1 不同測定方法實驗結(jié)果Table 1 Results obtained with different methods

表 2 加入大米中Hg(NO 的檢測結(jié)果Table 2 Recoveries from rice samples spiked with Hg(NO3)2

3 結(jié) 論

本實驗利用含有T堿基錯配部分互補的兩條單鏈核酸，結(jié)合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ，建立了一種大米中Hg2+的定量檢測方法。這種分析方法簡單快速、選擇性好、靈敏度高、檢出限低。將這種分析方法應(yīng)用于大米中Hg2+的檢測，獲得了滿意的結(jié)果。

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Dual Color Fluorescence Quantitative Detection of Mercury in Rice

ZHAI Kun1,2, WANG Lianzhi2，XIANG Dongshan1,2,*
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China; 2. School of Chemical and Environmental Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

A highly sensitive and selective dual color fl uorescence quantitative detection method for mercury (Hg2+) in rice was developed by synchronous scanning fluorescence spectrometry. In this method, two complementary single-stranded nucleic acids with T-T mismatches, SYBR GreenⅠ and graphene oxide were employed. Under the optimum conditions, the total fl uorescence intensity of SYBR GreenⅠ and carboxy-X-rhodamine (ROX) exhibited good linear dependence on the quantity of Hg2+in the range of 5 × 10-10–500 × 10-10mol/L. The fi tted regression equation was ?IT= 2.121 3 C + 10.536 0 with a detection limit of 2 × 10-10mol/L (3σ). The proposed method displayed a good precision, high selection, simple operation, fast detection, low detection limit and high sensitivity. This method has been applied with satisfactory results.

mercury; quantitative detection; dual color fl uorescence; rice

S132

A

1002-6630（2015）02-0179-05

10.7506/spkx1002-6630-201502034

2014-04-08

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（21465010；31460172）；湖北省教育廳重點項目（D20131905；D20131906）；

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室開放基金項目（PKLHB1316）；湖北省林學(xué)一級學(xué)科資助項目

翟琨（1978—），女，副教授，碩士，研究方向為土壤化學(xué)與環(huán)境。E-mail：zk3100@sina.com

*通信作者：向東山（1974—），男，副教授，博士，研究方向為分析化學(xué)。E-mail：zk3100@sohu.com