丁 芳(綜述)，周紅林(審校)

(1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650101)

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哺乳動(dòng)物胚胎體外培養(yǎng)的研究進(jìn)展

丁 芳1※(綜述)，周紅林2(審校)

(1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650101)

葡萄糖對(duì)卵裂階段胚胎的發(fā)育有抑制作用，但早期胚胎體外發(fā)育中添加葡萄糖并不是完全不必要的，8-細(xì)胞前需要非必需氨基酸，8-細(xì)胞及以后利用所有氨基酸。低濃度必需氨基酸促進(jìn)胚胎發(fā)育，高濃度必需氨基酸抑制胚胎發(fā)育。牛血清白蛋白等大分子物質(zhì)既能供給胚胎營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分裂，又能消除血清的不利影響，是很好的蛋白質(zhì)替代品，一些生長(zhǎng)因子對(duì)胚胎發(fā)育起積極作用。共培養(yǎng)及序貫培養(yǎng)雖可以改善胚胎發(fā)育狀況，但也存在一些負(fù)面影響。

哺乳動(dòng)物；胚胎；體外培養(yǎng)

哺乳動(dòng)物早期胚胎的體外培養(yǎng)已經(jīng)歷了半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，大量的實(shí)驗(yàn)室研究主要集中在培養(yǎng)液優(yōu)化上，對(duì)于培養(yǎng)液的優(yōu)化主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一種是改進(jìn)化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液，如在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液中適當(dāng)減除、替代或添加某些組分來(lái)改進(jìn)培養(yǎng)液，因此需要掌握簡(jiǎn)單培養(yǎng)液中的基本成分有哪些及各自的作用是什么，這樣才有利于對(duì)處理因素的觀察分析，有利于探討早期胚胎的發(fā)育機(jī)制；另一種采用體細(xì)胞與胚胎共同培養(yǎng)，或?qū)⑴咛ピ诓煌l(fā)育階段放入不同培養(yǎng)液中進(jìn)行序貫培養(yǎng)等，其目的在于提高哺乳胚胎的體外發(fā)育率、種植率及妊娠率。該文旨在研究哺乳動(dòng)物胚胎最佳體外培養(yǎng)條件，以期體外培養(yǎng)胚胎更接近體內(nèi)自然狀態(tài)，從而進(jìn)一步推動(dòng)生命科學(xué)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。

1 培養(yǎng)液及其發(fā)展

自1956年Whitten[1]成功實(shí)現(xiàn)小鼠胚胎體外的培養(yǎng)以來(lái)，培養(yǎng)基經(jīng)歷了無(wú)數(shù)次的更新與發(fā)展，如早期的簡(jiǎn)單培養(yǎng)液、Brinster′s培養(yǎng)液、修正的Whitten′s培養(yǎng)液、M16、MTF和HTF培養(yǎng)液等，這些培養(yǎng)液雖然在一些品系的小鼠上取得成功，但遇到一個(gè)共同的難題，即“2-細(xì)胞阻滯”現(xiàn)象。Chatot等[2-3]發(fā)明了CZB培養(yǎng)液，同時(shí)用該培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎，使部分品系的小鼠突破了2-細(xì)胞阻滯現(xiàn)象，發(fā)育到囊胚。隨后，Lawitts和Biggers[4]設(shè)計(jì)了KSOM培養(yǎng)液，增加更多品系小鼠胚胎的囊胚發(fā)育率。復(fù)合培養(yǎng)液同樣經(jīng)歷了無(wú)數(shù)次的改進(jìn)，最早的復(fù)合培養(yǎng)液有20世紀(jì)50年代設(shè)計(jì)的Ham′sF10、TCM199，隨后80年Keefer等[5]發(fā)現(xiàn)了BME和Ham′sF10(1∶1)的混合培養(yǎng)液，證實(shí)該培養(yǎng)液更利于兔胚胎的體外發(fā)育。后來(lái)，Jin等[6]發(fā)現(xiàn)了RDH(RPMI1640/DMEM/Ham′s F10 1∶1∶1)和RD(RPMI1640/DMEM 1∶1)的混合培養(yǎng)液，同時(shí)體外培養(yǎng)囊胚成功并獲得仔兔。每一次發(fā)現(xiàn)都在不同程度上改善了哺乳動(dòng)物胚胎的體外發(fā)育率，都是生命科學(xué)史上里程碑的一次突破。

2 培養(yǎng)液主要成分

2.1 能量底物 哺乳動(dòng)物輸卵管液和子宮液中的主要能量底物有丙酮酸、乳酸及葡萄糖，不同物種的生殖道中，這3種能量底物的濃度各不相同。研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物早期胚胎卵裂階段的主要供能物質(zhì)是丙酮酸和乳酸，葡萄糖對(duì)卵裂階段胚胎的發(fā)育有抑制作用，致密化期以后主要利用葡萄糖供能。然而，近年來(lái)研究表明，葡萄糖對(duì)綿羊、豬的植入前胚胎的體外發(fā)育無(wú)抑制作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，一種含有恒定濃度4.7 mmol/L 葡萄糖的復(fù)雜培養(yǎng)液，能完全支持人類受精卵發(fā)育到囊胚階段[8]。生理狀態(tài)下哺乳動(dòng)物輸卵管和子宮液中能檢測(cè)到葡葡糖的存在，由此可以推測(cè)，早期胚胎體外培養(yǎng)液中葡萄糖的添加并不是完全不必要的，葡萄糖在早期胚胎體外發(fā)育中具體的作用時(shí)間及作用機(jī)制目前尚不完全清楚。

2.2 氨基酸 自1990年國(guó)外研究者首次發(fā)現(xiàn)了氨基酸在小鼠胚胎體外培養(yǎng)中的作用以來(lái)，人們對(duì)氨基酸進(jìn)行了反復(fù)的研究，Eagle將氨基酸分為必需氨基酸和非必需氨基酸，在2-細(xì)胞階段添加非必需氨基酸和谷氨酸能提高小鼠囊胚形成率、細(xì)胞數(shù)、孵化率和移植后發(fā)育潛力[9-10]。非必需氨基酸還能促進(jìn)8～16細(xì)胞到囊胚階段哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育[11]，8-細(xì)胞前添加必需氨基酸抑制囊胚的發(fā)育[4]，8-細(xì)胞階段添加必需氨基酸卻能促進(jìn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育和隨后胎兒的發(fā)育[12]，低濃度的必需氨基酸對(duì)水牛體外受精-胚胎移植的胚胎的發(fā)育具有一定促進(jìn)作用,但高濃度則有抑制作用[13]。必需氨基酸的濃度降到半濃度時(shí)，能提高小鼠植入前胚胎的體外發(fā)育[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的必需氨基酸代謝和自由降解中會(huì)產(chǎn)生對(duì)胚胎有毒性的銨。當(dāng)以1 mmol/L的谷氨酰胺衍生物丙氨?；?谷氨酰胺替代谷氨酰胺時(shí)，可以顯著降低銨的生成[14]。同時(shí)添加必需和非必需氨基酸到MSOM培養(yǎng)液中，濃度為Eagle′s培養(yǎng)液一半時(shí)，能支持小鼠受精卵發(fā)育到囊胚后期，而且能促進(jìn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的增殖[15]。

2.3 蛋白質(zhì)和大分子物質(zhì) 有研究發(fā)現(xiàn)，血清能提高早期胚胎體外發(fā)育的囊胚率[16]，培養(yǎng)系統(tǒng)中血清成分的缺乏會(huì)影響胚胎表面微絨毛的發(fā)育。胎牛血清可以促進(jìn)豬孤雌胚胎的早期體外發(fā)育[17]。添加混合血清能促進(jìn)水牛胚胎體外發(fā)育[18]。牛血清白蛋白對(duì)山羊體外受精卵具有明顯促卵裂作用[19]。胰島素樣生長(zhǎng)因子2、胰島素能增加體外培養(yǎng)的囊胚細(xì)胞數(shù)[20]，表皮生長(zhǎng)因子及胰島素樣生長(zhǎng)因子2對(duì)體外培養(yǎng)鼠胚的發(fā)育有協(xié)同促進(jìn)作用[21]。0.1 μg/L胰島素樣生長(zhǎng)因子2和表皮生長(zhǎng)因子作為胚胎培養(yǎng)濃度較佳[22]。白細(xì)胞抑制因子促進(jìn)2～8細(xì)胞胚胎發(fā)育至桑椹胚，同時(shí)也能促進(jìn)桑椹胚向擴(kuò)大囊胚和孵化囊胚發(fā)育，白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素6及干擾素γ對(duì)綿羊早期胚胎的發(fā)育無(wú)顯著影響[23]。

3 培養(yǎng)體系的改進(jìn)

3.1 共培養(yǎng) 國(guó)外有研究證實(shí)不合適的培養(yǎng)體系可以導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，20世紀(jì)80年代末期，研究者們研究出一種新型的培養(yǎng)技術(shù)——細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞共培養(yǎng)是將2種或2種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，共培養(yǎng)能使細(xì)胞間相互溝通信息，相互支撐生長(zhǎng)增殖，能更真實(shí)地模擬體內(nèi)環(huán)境。國(guó)內(nèi)研究者認(rèn)為共培養(yǎng)體系主要有以下優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)細(xì)胞向另一種細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞自身的分化、維持細(xì)胞的功能和活力、對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控、促進(jìn)早期胚胎的發(fā)育和提高代謝物的產(chǎn)量。有學(xué)者采用人卵丘細(xì)胞、昆明鼠卵丘細(xì)胞、昆明鼠成纖維細(xì)胞分別與昆明鼠2細(xì)胞期胚胎共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同類型的體細(xì)胞共培養(yǎng)體系均可在體外為胚胎發(fā)育提供一種更類似于體內(nèi)的環(huán)境，有利于胚胎在體外發(fā)育[24]。含有小鼠輸卵管上皮細(xì)胞+垂體細(xì)胞的CZB培養(yǎng)液可有效促進(jìn)小鼠孤雌胚胎突破2細(xì)胞阻滯[25]。在體外環(huán)境下,牛體外胚胎與子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)后能正常孵化[26]。共培養(yǎng)能顯著提高2-細(xì)胞發(fā)育率、降低胚胎內(nèi)部H2O2水平，提高4-細(xì)胞率及降低胚胎內(nèi)部H2O2水平[27]。

3.2 序貫培養(yǎng)與序貫共培養(yǎng) 與胚胎培養(yǎng)全程在同一培養(yǎng)液中進(jìn)行遠(yuǎn)不能滿足胚胎對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，鑒于這一理論，人們提出了序貫培養(yǎng)，常用的序貫培養(yǎng)液有用于人胚胎培養(yǎng)G1/G2。劉軍等[28]研究證實(shí)，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)液相比，序貫培養(yǎng)液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的發(fā)育。G1/G2支持綿羊、牛和豬的體外受精胚胎發(fā)育的報(bào)道也屢見不鮮。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，SOF培養(yǎng)液和顆粒細(xì)胞+添加胎牛血清的NCSU-23 輸卵管上皮細(xì)胞的序貫培養(yǎng)系統(tǒng)能較好地促進(jìn)胚胎的發(fā)育。后來(lái)，有學(xué)者又將序貫培養(yǎng)和共培養(yǎng)聯(lián)合起來(lái)對(duì)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)序貫聯(lián)合子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)的方法與單純的體外序貫培養(yǎng)相比，其囊胚形成率更高，是進(jìn)行廢胚繼續(xù)體外培養(yǎng)的更有效方法[29]。冷凍胚胎經(jīng)序貫共培養(yǎng)能改善胚胎發(fā)育潛能，子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)聯(lián)合序貫成組培養(yǎng)對(duì)人早期冷凍時(shí)限較長(zhǎng)的胚胎發(fā)育具有積極的支持作用[30-31]。

4 小 結(jié)

哺乳動(dòng)物著床前胚胎培養(yǎng)是一個(gè)不斷發(fā)展的領(lǐng)域，目前的培養(yǎng)基及培養(yǎng)體系尚需進(jìn)一步完善，以期體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境最接近，但由于脫離母體環(huán)境，胚胎的發(fā)育率及質(zhì)量仍有很多問(wèn)題。如體外發(fā)育過(guò)程中暫時(shí)結(jié)構(gòu)正常，隨后可能出現(xiàn)基因分化、染色體變異等，這可能是細(xì)胞凋亡、胚胎流產(chǎn)、死亡的重要原因，因此，培養(yǎng)基及培養(yǎng)體系的改進(jìn)是一個(gè)值得長(zhǎng)期深入研究的課題。

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Research Progress in Mammalian Embryos Cultured in Vitro

DINGFang1，ZHOUHong-lin2.

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,RenheHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang443001，China; 2.DepartmentofGynecology,the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Glucose has inhibitory effect on embryos development in cleavage stage,but it is unnecessary to add glucose in early embryos development in vitro,embryos before stage of 8-cells need non-essential amino acid,embryos of and after stage of 8-cells need all amino acids.Low concentration of essential amino acids can promote the embryonic development,while high concentration of essential amino acids inhibit embryonic development.Bovine serum albumin and other macromolecules can supply nutrition to the embryos,as well as promote cell growth,proliferation,differentiation,and eliminate the adverse effects of serum,which makes them very good protein substitutes.Many growth factors also have positive effects on embryonic development.Coculture and sequential culture can improve the status of embryonic development,although there are also some negative effects.

Mammals; Embryo; Culture in vitro

S814.8

A

1006-2084(2015)12-2166-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.020

2013-08-30

2014-11-03 編輯：伊姍