孫 超，丘雪紅，曹 莉，韓日疇*

(1.安徽大學(xué)，合肥 230601;2.廣東省昆蟲研究所，廣東省農(nóng)業(yè)害蟲綜合治理重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

冬蟲夏草Ophicordyceps sinensis 屬于線性蟲草菌科Ophiocordycipitaceae，是冬蟲夏草真菌寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae 昆蟲中形成的菌核和子座復(fù)合物，在我國主要分布在甘肅、青海、四川、西藏、云南等省3000-5200 m 的高海拔地區(qū) (Sung et al.，2007;Yue et al.，2013)。作為中國名貴的中藥，冬蟲夏草被證實具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等功效 (武忠偉等，2008;Yang et al.，2011;Mei et al.，2014;Wu et al.，2014)。

利益驅(qū)使不法商販用混淆品代替冬蟲夏草，造成市場混亂。性狀和顯微鑒別易觀察，成為許多學(xué)者鑒別真假的手段(陳小秋等，2011)。冬蟲夏草真菌的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(international transcribed spacer，ITS)和蝙蝠蛾昆蟲的細(xì)胞色素b序列(Cytochrome b，Cytb)在冬蟲夏草復(fù)合體中保守，可用作為分子鑒定 (Rehner and Buckley，2005;Jiang and Yao，2005;Zhang et al.，2009)。

在冬蟲夏草中的腺苷、肌苷、麥角甾醇、蟲草酸和多糖等具有多種藥理活性，可作為冬蟲夏草質(zhì)量評價的指標(biāo)(Li et al.，2006)。Dong and Yao (2012)發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草發(fā)酵液具有較強的DPPH 自由基清除活性。Wu et al.(2007)證實冬蟲夏草乙酸乙酯提取液對小鼠黑色素瘤細(xì)胞具有抑制作用。

陳婷等(2013)曾以冬蟲夏草中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量評價不同產(chǎn)地冬蟲夏草的質(zhì)量。嚴(yán)冬和楊鑫嵎(2014)以氨基酸的含量評價不同產(chǎn)地冬蟲夏夏草的質(zhì)量。不同產(chǎn)地的冬蟲夏草從形態(tài)上難以評價質(zhì)量的優(yōu)劣，單一的生化指標(biāo)又不能全面反映其所體現(xiàn)的整體療效 (Xiao et al.，2013)。

本文采用性狀、顯微和分子標(biāo)記鑒別冬蟲夏草樣品，然后從冬蟲夏草主要活性成分含量、抗自由基和抗癌細(xì)胞等方面測定不同產(chǎn)地冬蟲夏草質(zhì)量指標(biāo)，為綜合、科學(xué)評價冬蟲夏草質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本文所用的冬蟲夏草樣品分別采集于青海(玉樹州)、四川(康定縣)、西藏(當(dāng)雄縣)和云南(白馬雪山)。

1.2 冬蟲夏草鑒別

1.2.1 性狀和顯微鑒別

將冬蟲夏草置于體視顯微鏡 (Olympus SZX16)下觀察，拍攝記錄頭部、胸部、腹部和足等結(jié)構(gòu)。將蟲體浸潤在清水中，蟲體變軟后，手持刀片刮取蟲體的第5 腹節(jié)第1 小節(jié)的體壁和腹足，置于蓋玻片上(康帥等，2013)。向蓋玻片上滴加適量的水合氯化醛溶液，在50℃烘箱中加熱10 min 至透明化。冷卻后，滴加適量60% 甘油，加蓋玻片，置于熒光顯微鏡(Nikon 80i)下觀察，拍攝記錄刺毛、剛毛、毛片、氣門、腹足和趾鉤等結(jié)構(gòu)(王創(chuàng)新等，2013)。

1.2.2 分子鑒別

以Hipure Fungal DNA Kit (廣州欣妍科技生物有限公司)分別提取樣品子座和蟲體的基因組DNA。采用真 通用引 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-3')和 ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')擴增樣品子座的ITS 序列，PCR 擴增條件和方法參照毛雄明等(2013)。采用引物CB1 (5'-TATGTACTACCAT GAGGACAAATATC-3')和CB2 (5'-ATTACACC TCCTAATTTATTAGGAAT-3')擴增樣品蟲體的Cytb 序列，PCR 擴增條件和方法參照程舟等(2007)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京華大基因公司測序。登陸NCBI 網(wǎng)站進行核苷酸序列比對與分析，進行相似性分析。

1.3 冬蟲夏草活性成分含量測定

1.3.1 腺苷

稱取0.5 g 樣品粉末，加蒸餾水45 mL，超聲波提取30 min。冷卻后，定容至50 mL。在3000 rpm離心3 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后供液相色譜分析用。色譜柱為C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫35℃。流動相為甲醇和0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(10∶90，v/v)，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為254 nm (Ikeda et al.，2008)。

1.3.2 肌苷

稱取0.2 g 樣品粉末，加20 mL 蒸餾水，超聲波提取30 min。冷卻后，定容至25 mL。在3000 rpm離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后供液相色譜分析用。色譜柱為C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫30℃。流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為254 nm (Ikeda et al.，2008)。

1.3.3 麥角甾醇

稱取1.0 樣品粉末，置于回流裝置的150 mL三角瓶中，加入0.2 g 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、0.6 g 維生素C、2 g 焦性沒食子酸和25 mL 甲醇，在80℃恒溫水浴回流5 min。從冷凝回流管頂部加入5 mL 50%氫氧化鉀溶液，繼續(xù)回流30 min。冷卻結(jié)束后，用正己烷過濾。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮蒸干，殘渣用4.0 mL 正己烷溶解，用0.45 μm 濾膜過濾，供高效液相色譜分析測定。色譜柱為 Inertsisil-100A 硅膠柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫40℃。流動相為正己烷和異丙醇溶液(99∶1，v/v)，流速為2.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為282 nm (Yuan et al.，2007)。

綜上所述,導(dǎo)師素質(zhì)既直接影響研究生的學(xué)術(shù)水平,又通過影響研究生的學(xué)術(shù)感知力間接影響研究生的學(xué)術(shù)水平,本文所構(gòu)建的理論模型如圖1所示。

1.3.4 蟲草酸

稱取0.5 g 樣品粉末，加蒸餾水45 mL，超聲波提取30 min。冷卻后，定容至50 mL。在3000 rpm離心3 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后供液相色譜分析用。色譜柱為Prevail carbohydrate ES 糖柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫30℃。流動相為乙腈和蒸餾水(75∶25，v/v)，流速為1.0 mL/min，進樣量 5 μL (Ikeda et al.，2008)。

1.3.5 多糖

稱取1.0 g 樣品粉末，加5 mL 蒸餾水浸潤樣品，緩慢加入20 mL 無水乙醇。混勻后，超聲提取30 min。在4000 rpm 下離心10 min，沉淀用10 mL 80%乙醇洗滌。用50 mL 蒸餾水將沉淀轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在沸水中提取2 h。冷卻至室溫，將上清液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加蒸餾水定容至100 mL。向1.0 mL 樣品溶液中加入1.0 mL 苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL 硫酸溶液，靜置10 min。溶液液充分混合，將試管放置于30℃水浴中反應(yīng)20 min，490 nm 測定吸光度值(陰婉婷等，2015)。

1.4 抗DPPH 自由基

稱取1.0 g 樣品粉末置于錐形瓶中，加入80 mL 甲醇，置于150 rpm、25℃搖床上搖勻1 h。濾紙過濾，收集上清液。殘渣用40 mL 甲醇再提取一次，合并兩次上清液。在40℃水浴中蒸發(fā)濃縮，用75%甲醇溶解提取物。在96 孔板中，每孔加6×10-5mol/L 二苯代苦味酰自由基溶液(DPPH)270 μL，75%甲醇提取物溶液30 μL，避光靜止25℃反應(yīng)30 min 后，在515 nm 波長下測定各孔吸光值。用BHT 作為陽性對照，DPPH 自由基清除率=［1-(A處理-A調(diào)零)/ (A對照-A調(diào)零)］×100%。其中，A處理表示孔板中有樣品溶液和DPPH 溶液，A對照表示孔板中有DPPH 溶液，A調(diào)零表示孔板中只有75% 甲醇溶液。半數(shù)效應(yīng)濃度(the half maximal inhibiting concentration，IC50)表示DPPH 自由基清除率為50%時樣品中提取物的濃度(Reis et al.，2013)。

1.5 抗小鼠乳腺癌細(xì)胞(breast cancer)MT-1

在96 孔板中，每孔加入50 μL MT-1 細(xì)胞溶液，鋪板使細(xì)胞密度至8000-10000 個/孔。5%CO2，37℃孵育，培養(yǎng)4 h 待細(xì)胞貼壁。加入濃度梯度的藥物(將甲醇提取的樣品有效物用二甲基亞砜DMSO 溶解)，每孔50 μL，3 個復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育44 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入40 μL 2.5 mg/mL 噻唑藍(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm 波長下測量各孔的吸光值。用5-氟尿嘧啶(5-FU)陽性對照，癌細(xì)胞致死率=［1-(A處理-A調(diào)零)/ (A對照-A調(diào)零)］×100%。A處理表示孔板中有樣品溶液、MT-1 細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)液 (dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、MTT 和DMSO，A對照表示孔板中有細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、DMEM培養(yǎng)液、MTT 和DMSO，A調(diào)零表示孔板中只有DMEM 培養(yǎng)液、MTT 和 DMSO (Wu et al.，2007)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

不同產(chǎn)地冬蟲夏草中活性成分的含量均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)以10 為底的對數(shù)函數(shù)處理;不同產(chǎn)地冬蟲夏草DPPH 自由基清除率用半數(shù)效應(yīng)濃度IC50表示;不同產(chǎn)地冬蟲夏草對癌細(xì)胞致死率用百分?jǐn)?shù)表示，百分?jǐn)?shù)經(jīng)開方、反正弦變換處理。以SPSS 16.0 進行方差分析，多重比較采用Tukey 檢驗，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草鑒別

對從青海、四川、西藏、云南采集的冬蟲夏草樣品進行性狀和顯微特征觀察，發(fā)現(xiàn)頭部、胸部、腹部、足、毛片和氣門等結(jié)構(gòu)與參考文獻基本一致(陳小秋等，2011;Au et al.，2012;康帥等，2013)。不同產(chǎn)地樣品子座的ITS 序列與GenBank 中冬蟲夏草菌的ITS 序列相似度達到98%以上，樣品蟲體的Cytb 序列與GenBank 中蝙蝠蛾的Cytb 序列相似度達到98% 以上。綜合以上結(jié)果，確定從青海、四川、西藏和云南采集的樣品均為冬蟲夏草。

圖1 不同產(chǎn)地冬蟲夏草中腺苷、肌苷和麥角甾醇的含量Fig.1 The contents of adenosine，inosine and ergosterol of Ophiocordyceps sinensis from different origins

2.2 活性成分含量

在冬蟲夏草中，蟲草酸和多糖含量較高，其次是麥角甾醇，肌苷和腺苷的含量較少(圖1 和圖2)。不同產(chǎn)地冬蟲夏草中，腺苷、肌苷、麥角甾醇、蟲草酸和多糖的含量均存在顯著性差異。蟲草酸和多糖含量從大到小的產(chǎn)地依次是青海、西藏和云南(三者之間無顯著性差異)，四川;麥角甾醇含量從大到小的產(chǎn)地依次是青海和西藏，四川和云南;肌苷含量從大到小的產(chǎn)地依次是云南，青海和西藏，四川;腺苷含量從大到小的產(chǎn)地依次是云南，青海，四川，西藏。從測定的活性成分含量來看，云南和青海冬蟲夏草的含量均較高，四川冬蟲夏草的含量偏低。

2.3 抗DPPH 自由基

DPPH 自由基在甲醇溶液中呈現(xiàn)出深紫色，冬蟲夏草具有清除DPPH 自由基等抗氧化能力，冬蟲夏草甲醇提取液將DPPH 還原，并呈現(xiàn)出淺黃色或無色。通過酶標(biāo)儀檢測，能推斷出DPPH 清除率，顯示冬蟲夏草的抗氧化活性。IC50值越小表示清除能力越強。不同產(chǎn)地冬蟲夏草和BHT 的IC50存在顯著性差異，其清除DPPH 自由基能力由大到小依次是BHT，云南和西藏(兩者未呈現(xiàn)顯著差異)，以及青海和四川(兩者未呈現(xiàn)顯著差異)(圖3)。

圖2 不同產(chǎn)地冬蟲夏草中蟲草酸和多糖的的含量Fig.2 The content ofcordycepic acid and polysaccharide of Ophiocordyceps sinensis from different origins

圖3 不同產(chǎn)地冬蟲夏草和BHT 清除DPPH 自由基的半數(shù)效應(yīng)濃度IC50Fig.3 The half maximal inhibiting concentrations of the scavenging ability of BHT and Ophiocordyceps sinensis from different origins on DPPH

2.4 抗MT-1

MTT 作為一種黃色顯色試劑，能被活細(xì)胞還原成水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，易溶于DMSO。通過酶標(biāo)儀檢測，能推斷出細(xì)胞存活率，顯示藥物的抗癌活性。對抗癌藥物5-FU 而言，不同產(chǎn)地冬蟲夏草的甲醇提取液對癌細(xì)胞致死率的效果極差，致死率之間沒有顯著性差異(圖4)。當(dāng)冬蟲夏草提取物濃度為400 μg/mL 時，對MT-1 致死率小于20%，說明甲醇提取物對MT-1 沒有顯著地抑制效果，其半數(shù)效應(yīng)濃度IC50沒有實際的意義。

圖4 不同產(chǎn)地冬蟲夏和5-FU 在濃度為400 μg/mL 時對MT-1 的致死率Fig.4 The MT-1 death rates of 5-FU and Ophiocordyceps sinensis from different origins，at the concentration of 400 μg/mL

3 結(jié)論與討論

盡管冬蟲夏草市場上的產(chǎn)品真假難辨，但性狀特征、顯微特征和分子方法能驗證。本研究從青海、云南、西藏、四川采集的樣品均為冬蟲夏草。

腺苷、肌苷、麥角甾醇、蟲草酸和多糖5種活性物質(zhì)在冬蟲夏草內(nèi)含量穩(wěn)定，且具有多種藥理作用。Li et al.(2002)測定冬蟲夏草內(nèi)的多糖含量為3-8 g/100 g。Yuan et al.(2007)測定冬蟲夏草內(nèi)麥角甾醇的含量為178.5-275.5 mg/100 g。李進等(2008)測定冬蟲夏草中腺苷的含量為10-58 mg/100 g，肌苷的含量為73-189 mg/100 g。Wang et al.(2009)測定冬蟲夏草內(nèi)蟲草酸的含量約為9 g/100。本次實驗從青海、四川、西藏和云南采集的冬蟲夏草中，腺苷、肌苷、麥角甾醇、蟲草酸和多糖均存在顯著性差異，蟲草酸和多糖的含量較高，麥角甾醇的含量次之。如果僅從5種活性成分的含量評價，云南和青海冬蟲夏草含量較高，四川冬蟲夏草所測組分含量較低。

Pereiraet al.(2012)測定二十多種野生食用蘑菇的 DPPH 自由基清除率 IC50是0.86-20.02 mg/mL。Reis et al.(2013)測定蛹蟲草中的DPPH 自由基清除率IC50是12.17 mg/mL。本次測定不同產(chǎn)地冬蟲夏草的DPPH 自由基清除率IC50值均小于蛹蟲草的IC50，冬蟲夏草對DPPH 自由基的清除活性似強于蛹蟲草。不同產(chǎn)地冬蟲夏草的DPPH 自由基清除率存在顯著性差異，西藏和云南的冬蟲夏草清除DPPH 自由基活性較強。在冬蟲夏草中，酚類化合物和多糖與自由基的清除有關(guān)(Li et al.，2003;Heleno et al.，2010)。

張巧霞等(2005)分別用乙酸乙酯、乙醇和水提取冬蟲夏草，當(dāng)提取物為濃度均為100 μg/mL時，對小鼠黑素瘤細(xì)胞的致死率分別為56.5%、21.6%和0.6%。本研究以甲醇從不同產(chǎn)地冬蟲夏草中提取的活性物質(zhì)對小鼠MT-1 抑制效果較弱，不同產(chǎn)地冬蟲夏草之間不存在顯著性差異。根據(jù)已知結(jié)果推斷，非極性有機溶劑提取的活性物質(zhì)的抗癌效果似優(yōu)于極性大的溶液。在冬蟲夏草中，腺苷和麥角甾醇被證明具有抗癌作用 (Fishman et al.，2002;張嫻等，2011)。

本文對采集自青海、四川、西藏、云南的冬蟲夏草進行形態(tài)和分子鑒定，分析5種主要活性成分的含量，測定抗DPPH 自由基和抗癌細(xì)胞活性，為綜合評價冬蟲夏草質(zhì)量提供參考，有助于這一名貴資源的可持續(xù)利用。

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