徐廣增，劉守柱*，梁婷婷，楚成茹，潘立婷，李 婷

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252059;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642)

隨著殺蟲劑的廣泛使用和數(shù)量的逐年增多，其持續(xù)選擇壓力逐漸增強(qiáng)，越來(lái)越多的昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，到目前為止，已有600 多種昆蟲及螨類對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生了抗性 (何書海等，2006)。昆蟲的抗性主要分為代謝抗性和靶標(biāo)抗性，代謝抗性指昆蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、非專一性酯酶、細(xì)胞色素P450 氧化酶系等代謝、分解或轉(zhuǎn)化外來(lái)有毒物質(zhì)而產(chǎn)生的抗性;靶標(biāo)抗性指昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶、γ-氨基丁酸受體和鈉離子通道等靶標(biāo)對(duì)殺蟲劑敏感度降低而產(chǎn)生的抗性(王敦等，2006;周斌芬等，2008)。昆蟲抗性的產(chǎn)生與增強(qiáng)，加大了農(nóng)林業(yè)害蟲防治的難度，新型農(nóng)藥的研制迫在眉睫，在昆蟲體內(nèi)尋找新的作用靶標(biāo)可為新型農(nóng)藥的研發(fā)提供思路，而酚氧化酶即是最有希望的靶標(biāo)之一。

酚氧化酶(PO，Phenoloxidase)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物等有機(jī)體內(nèi)，又稱為酪氨酸酶(tyrosinase)，是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶(李國(guó)榮等，2003)。昆蟲在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷多次蛻皮現(xiàn)象，新形成的表皮顏色較淺且柔軟，對(duì)外界環(huán)境及病毒微生物的抵抗力較弱，需在PO的催化作用下完成鞣化和黑化作用而使表皮變黑、變硬;當(dāng)昆蟲受到外來(lái)病原菌或寄生蟲侵入時(shí)，體內(nèi)無(wú)活性的酚氧化酶原 (prophenoloxidase，PPO)被激活轉(zhuǎn)化為PO，催化產(chǎn)生黑色素與形成的包囊或結(jié)節(jié)將病原微生物消滅 (Clark and Strand，2013)。鑒于PO 在昆蟲的免疫、防御系統(tǒng)中起著重要的作用，因而可以作為害蟲控制的一個(gè)作用靶標(biāo)。篩選對(duì)PO 具有強(qiáng)力抑制作用的化合物是開(kāi)發(fā)以PO 為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥的有效途徑。許多化合物對(duì)PO 具有較好的抑制作用，較多的是取代苯酸類，如:對(duì)羥基苯甲酸、硫脲等;極地與深海生境鏈霉菌產(chǎn)生的吲哚咔唑生物堿能夠?qū)Σ饲嘞x酚氧化酶具有一定的抑制作用和殺蟲活性(王可等，2015);一些寄生蜂，如半閉彎尾姬蜂Diadegma semiclausum 寄生小菜蛾P(guān)lutella xylostella后也能有效抑制小菜蛾血淋巴中的酚氧化酶前體的激活(黃芳等，2011);此外，一些植物中的天然化合物對(duì)PO 也有抑制作用如:槲皮素、銀杏葉提取物等(羅萬(wàn)春和薛超彬，2010)，由于植物中的化合物是天然產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境友好、易降解，符合無(wú)公害農(nóng)業(yè)的發(fā)展潮流，因而從植物中提取、篩選PO 抑制劑有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

剛竹Phyllostachys viridis (Young)Mc Clure 是國(guó)內(nèi)廣泛種植的綠化植物，竹葉中含有多種復(fù)雜的次生代謝物，具有抗氧化、抗自由基、抗菌、抗病毒、抗衰老、降血脂等功能，且對(duì)蚜蟲、棉鈴蟲、菜青蟲等生長(zhǎng)發(fā)育有一定的抑制作用，是我國(guó)新開(kāi)發(fā)的一類天然植物資源，具有很高的研究?jī)r(jià)值 (操海群等，2003;賴炘和陳其兵，2013)。本文以斜紋夜蛾Spodoptera litura 幼蟲酚氧化酶為靶標(biāo)，研究了剛竹葉提取物對(duì)PO 的作用效果，以期為開(kāi)發(fā)以PO 為靶標(biāo)的環(huán)境友好型的農(nóng)藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

斜紋夜蛾蟲源由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，在人工氣候養(yǎng)蟲室內(nèi)參照涂業(yè)茍等(2010)方法使用人工飼料繼代飼養(yǎng):室內(nèi)溫度25℃± 1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期L∶D=14 h∶10 h，收集2-3 日齡的5 齡幼蟲供試驗(yàn)用;剛竹葉采于聊城大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 試劑及儀器

本試驗(yàn)所用的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭笜?biāo)儀為BIO-RAD;冷凍離心機(jī)為D-37520，美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 竹葉提取物的制備

將供試植物材料(剛竹葉片)，用蒸餾水洗凈，烘箱低溫(50℃左右)烘干，然后用研缽研磨至粉末狀，取粉末120 g，分別裝入6 個(gè)錐形瓶中(各20 g)，分別加入10 倍體積的不同極性的溶劑(極性大小:去離子水＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞氯仿＞石油醚)，放置于恒溫水浴鍋中50℃加熱2 h 后，倒入布氏漏斗中抽濾，殘?jiān)偌尤軇┙?，連續(xù)浸泡3 次，合并濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)減壓濃縮至膏狀，稱重，按如下公式計(jì)算提取率:

提取率(%)=提取物干重(g)/植物干粉重(g)×100

粗提物置于4℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 酶液的制備

取斜紋夜蛾5 齡幼蟲，按1 g∶5 mL 的比例加入預(yù)冷處理的0.2 mol/L 磷酸緩沖液，冰浴勻漿，在4℃冰箱中靜置30 min 后，4℃，8000 r/min 離心30 min，取上清液即為粗酶液。在制備的粗酶液中加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使其飽和度達(dá)到30%，冰浴靜置30 min 后，4℃，8000 r/min離心30 min，收集鹽析后的沉淀物，將沉淀物用0.2 mol/L 磷酸緩沖液溶解，得到待測(cè)酶液。

1.3.3 酚氧化酶活力的測(cè)定

采用酶標(biāo)儀法進(jìn)行測(cè)定。在300 μL 測(cè)活體系中含有:0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)，終濃度0.01 mol/L 鄰苯二酚溶液，10 μL 酶制劑?；盍y(cè)定:在420 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定2 min 內(nèi)光密度隨時(shí)間的增長(zhǎng)曲線，每隔10 s 記錄一次，從直線的斜率求得酶活力。酶活力單位U 定義為每mg 蛋白每10 s 催化底物氧化光密度增加0.001 為1 個(gè)活力單位。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用G-250 考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行。每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.4 二甲基亞砜與吐溫80 對(duì)酚氧化酶活性的影響

將二甲基亞砜和吐溫80 按體積比1∶1 混合，300 μL 測(cè)活體系中，先加入10 μL 酶液，再加入150 μL 不同終含量的二甲基亞砜和吐溫80 (二甲基亞砜:吐溫80=1∶1，總含量設(shè)置為:50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5625%、0.78%、0.39%、0)，室溫下靜置5 min，最后加入140 μL 終濃度為0.01 mol/L 的鄰苯二酚溶液，按1.3.3 方法測(cè)定酶活力。與對(duì)照酶活力相比較，求得相對(duì)剩余活力，測(cè)定不同含量二甲基亞砜與吐溫80 對(duì)酚氧化酶活性的影響。

1.3.5 竹葉提取物對(duì)酚氧化酶抑制作用測(cè)定

將不同溶劑提取的竹葉提取物用少量的二甲基亞砜和吐溫80 (二甲基亞砜∶吐溫80=1∶1，終含量1.5%)溶解后，加入pH7.0 的磷酸緩沖液稀釋至2000 mg/L，備用。300 μL 測(cè)活體系中，先加入10 μL 酶液，再加入150 μL 不同終濃度的竹葉提取物(去離子水、乙醇、石油醚提取物終濃度分別 為1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100 和0 mg/L;丙酮和三氯甲烷提取物終濃度分別為600、500、400、300、200、100 和0 mg/L;乙酸乙酯提取物終濃度為700、600、500、400、300、200、100 和0 mg/L)，室溫下靜置5 min，最后加入140 μL 終濃度為0.01 mol/L的鄰苯二酚溶液，按1.3.3 方法測(cè)定酶活力。各處理剩余酶活力與對(duì)照酶活力相比較，以對(duì)照酶活力為100，求得相對(duì)剩余活力，測(cè)定不同溶劑提取物濃度與酶剩余相對(duì)活力的關(guān)系，計(jì)算求出IC50。

1.3.6 竹葉提取物對(duì)酚氧化酶抑制效應(yīng)的測(cè)定

取抑制效果最好的竹葉提取物 (丙酮提取物)，在測(cè)活體系中，固定鄰苯二酚的濃度，改變加入的酶量(分別為2、4、6、8、10 μL)，測(cè)定不同提取物濃度 (終濃度分別為0、100、200、300、400、500 mg/L)下酶活力隨加入的酶量變化的規(guī)律，以加入的酶量對(duì)酶剩余活力作圖，判斷提取物的抑制效應(yīng)。

1.3.7 竹葉提取物對(duì)酚氧化酶抑制類型和抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

取抑制效果最好的竹葉提取物 (丙酮提取物)，在測(cè)活體系中，固定酶量(10 μL)，改變鄰苯二酚的濃度 (終濃度分別為0.5、1、2、4、8 mmol/L)，測(cè)定不同提取物濃度(終濃度分別為0、100、200、300 mg/L)下酶活力隨底物濃度變化的規(guī)律，以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法作圖，比較提取物對(duì)表觀米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的影響，根據(jù)Km和Vm的變化規(guī)律判斷抑制類型，并求得抑制常數(shù)Ki。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤(SE，standard error)后，在圖中以平均值± SE 來(lái)表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯著水平P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉不同溶劑提取率比較

采用溫浸法制備了竹葉的6種不同溶劑(極性大小:去離子水＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞氯仿＞石油醚)的提取物，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉末狀，測(cè)得了不同溶劑提取物的提取率，結(jié)果表明:去離子水的提取率最高，可達(dá)30.17%，其次為乙醇，提取率為21.45%，石油醚的提取率最低，為1.28%，提取率有隨溶劑的極性降低而降低的趨勢(shì)(圖1)。

圖1 竹葉的不同溶劑提取率Fig.1 The extraction yield of different solvents

2.2 二甲基亞砜與吐溫80 對(duì)酚氧化酶活性的影響

由圖2 可知，二甲基亞砜和吐溫80 按體積比1∶1 混合后，當(dāng)含量在0-3.125%范圍內(nèi)時(shí)對(duì)PO起激活作用，且隨混合物含量的增加，激活作用先增加后降低;當(dāng)含量大于3.125%時(shí)，對(duì)PO 起抑制作用，且隨混合物含量的增加，抑制作用越來(lái)越強(qiáng)，當(dāng)混合物含量達(dá)50%時(shí)，PO 相對(duì)剩余活性僅為11.75%，故在溶解植物提取物時(shí)應(yīng)保證二甲基亞砜和吐溫80 混合物含量在3.125%之內(nèi)。

2.3 竹葉不同溶劑提取物對(duì)酚氧化酶活性的抑制作用

竹葉不同溶劑提取物對(duì)酚氧化酶的影響如圖2:三氯甲烷提取物在0-300 mg/L 范圍內(nèi)，對(duì)PO表現(xiàn)為激活作用，當(dāng)濃度大于300 mg/L 時(shí)，表現(xiàn)為一定的抑制作用;其他5種溶劑提取物在測(cè)定的范圍內(nèi)均對(duì)PO 表現(xiàn)為抑制作用，且隨提取物濃度的升高，抑制作用有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì);在6種不同溶劑提取物中，丙酮提取物對(duì)PO 的抑制效果最顯著，其IC50為550 mg/L，其次為乙酸乙酯提取物和乙醇提取物，其IC50分別為575 mg/L 和700 mg/L，其他3種溶劑提取物在可測(cè)的濃度范圍內(nèi)，對(duì)PO 的抑制效果均未達(dá)到50%。

圖2 二甲基亞砜與吐溫80 對(duì)酚氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of dimethyl sulfoxide and Tween 80 concentration on the activity of PO

圖3 不同溶劑提取物對(duì)斜紋夜蛾酚氧化酶活力的抑制作用Fig.3 The inhibition effect of different extracts against the PO activity from Spodoptera litura

2.4 丙酮提取物的酚氧化酶的抑制效應(yīng)

在測(cè)活體系中，固定底物鄰苯二酚的終濃度為10 mmol/L，加入不同濃度的丙酮提取物，然后改變加入的酶量，測(cè)定不同濃度的丙酮提取物對(duì)斜紋夜蛾酚氧化酶催化鄰苯二酚氧化活力的影響。圖3 表示PO 經(jīng)丙酮提取物作用后的剩余酶活力與加入的酶量之間的關(guān)系，分別以酶活力對(duì)酶量作圖得到一組過(guò)原點(diǎn)的直線，且隨提取物濃度的增大，直線的斜率逐漸降低。此結(jié)果表明竹葉的丙酮提取物對(duì)PO 的抑制作用屬于可逆過(guò)程。

2.5 竹葉丙酮提取物對(duì)酚氧化酶的抑制常數(shù)

在測(cè)活體系中，固定加入的酶量，改變底物鄰苯二酚的濃度，測(cè)定不同濃度的丙酮提取物對(duì)PO 活力的影響，以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，得到一組與橫軸交于一點(diǎn)直線(圖4)，說(shuō)明丙酮提取物不改變米氏常數(shù)(Km)，只影響最大反應(yīng)速度(Vm)，其抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。以不同濃度丙酮提取物條件下測(cè)定的1/Vm對(duì)提取物濃度作圖(圖5 內(nèi)插圖)得到一條直線，從直線的斜率求得抑制常數(shù)Ki為158.2 mg/L。

圖4 不同酶液量對(duì)斜紋夜蛾酚氧化酶活力影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the activity of PO from Spodoptera litura at different concentration of acetone extract

圖5 丙酮提取物對(duì)斜紋夜蛾酚氧化酶的抑制作用Fig.5 Linerweaver-Burk plots for inhibition of acetone extract on the activity of PO from Spodoptera litura

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了剛竹葉的不同溶劑提取物對(duì)PO的影響。溶劑的極性不同，所得提取物的主要成分不同，對(duì)PO 的影響存在較大的差異，但整體都表現(xiàn)為抑制作用(三氯甲烷提取物在0-300 mg/L范圍內(nèi)，對(duì)PO 表現(xiàn)為激活作用)。其中，丙酮提取物對(duì)PO 的抑制作用最強(qiáng)，IC50為550 mg/L，其次為乙酸乙酯提取物和乙醇提取物，其IC50分別為575 mg/L 和700 mg/L，而去離子水和石油醚提取物對(duì)PO 抑制作用較弱，在0-1000 mg/L 范圍內(nèi)抑制率低于40%。隨溶劑極性的降低，所得的提取物對(duì)PO 的抑制效果先升高后降低。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的剛竹提取物對(duì)PO 的IC50高于其他化合物，如7，4'-三羥基黃酮和槲皮素對(duì)菜青蟲PO 的IC50分別低至25.65 mg/L 和43.94 mg/L (薛超彬，2007)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得剛竹提取物的抑制效果不如已知純品化合物。分析原因，主要是本實(shí)驗(yàn)所用的是粗提物，含有大量雜質(zhì)，也可能含有一些具有激活作用的成分，通過(guò)測(cè)定34種不同采集地的竹葉提取物對(duì)酚氧化酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)有16種存在抑制作用，但不同采集地抑制效果存在差異，其他18種竹提取物對(duì)酚氧化酶則存在一定的激活作用(張永兵，2009)，故本試驗(yàn)所得竹葉粗提取總體表現(xiàn)對(duì)PO 的抑制作用不是很強(qiáng)。

以鄰苯二酚為底物，研究了剛竹的丙酮提取物對(duì)PO 的抑制效應(yīng)，結(jié)果表明:其抑制效果屬于可逆過(guò)程，抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但抑制常數(shù)較高，Ki為158.2 mg/L，主要原因依然是提取物純度不夠。剛竹提取物中含有多種成分，主要包括:黃酮及其苷類、多糖類、特種氨基酸及其肽類、芳香成分及多種微量元素(何躍君和岳永德，2008)。提取物具有較強(qiáng)的抗氧化和去除自由基作用，能夠有效的拮抗氧對(duì)PO 的激活作用;同時(shí)，可以清除過(guò)氧負(fù)離子、氫氧基和氧原子自由基等(酚氧化酶活性中心的橋聯(lián)配體，與PO 的活性有密切關(guān)系)，從而終止自由基鏈的發(fā)生，降低PO 的活性(賴炘和陳其兵，2013)。因而，剛竹提取物對(duì)PO 的抑制不是單一成分的作用，而是多種成分的綜合表現(xiàn)，其抑制機(jī)理較為復(fù)雜，需進(jìn)一步提純以后才能最終確定。

不同品種的竹葉提取物對(duì)PO 活性的抑制效果存在差異:張永兵(2009)曾探究了34種竹葉提取物對(duì)絡(luò)氨酸酶的影響，抑制效果較強(qiáng)的為毛環(huán)竹、翠竹、高節(jié)竹和闊葉箬竹，并對(duì)箬竹的活性成分進(jìn)行了分離鑒定，其活性成分主要是對(duì)羥基肉桂酸乙酯;王文文等(2010)測(cè)定了不同品種、不同季節(jié)竹筍醇提取物對(duì)絡(luò)氨酸酶單、雙酚酶活力的抑制作用，發(fā)現(xiàn)麻竹筍肉醇提取物抑制活性較高，且不同提取物間對(duì)PO 抑制活性差異較大。

許多研究表明，植物提取物中的黃酮類物質(zhì)，如:芹菜素、曲酸、木犀草素等，及鼠鞠草素、對(duì)羥基苯甲酸、槲皮素、山奈素、蘆丁、枯醛、枯酸、楊梅黃素和蛇葡萄素等都可以作為酚氧化酶的抑制劑，對(duì)PO 都有較強(qiáng)的抑制作用(羅萬(wàn)春和薛超彬，2010)。植物源的PO 抑制劑成分多種多樣，雖然抑制能力強(qiáng)弱不同，但由于其本身是天然化合物，對(duì)環(huán)境友好、易降解，兼之資源豐富，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。

農(nóng)藥的研發(fā)技術(shù)已經(jīng)由傳統(tǒng)的隨機(jī)篩選、類推合成、天然產(chǎn)物模板發(fā)展到了生物合理設(shè)計(jì)階段，對(duì)昆蟲、病原物等的生命活動(dòng)具有重要作用的酶以及酶促反應(yīng)是研究的重要靶標(biāo)。生物合理設(shè)計(jì)是研究開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥的有效途徑，如以幾丁質(zhì)合成酶(CS，Chitin synthase)為靶標(biāo)，已開(kāi)發(fā)出兩大類能夠破壞幾丁質(zhì)合成的抑制劑農(nóng)藥，一類是核苷肽類，包括多氧霉素(polyoxin)、三國(guó)霉素(nikkomycins)等(Hans，2006)，能夠通過(guò)抑制幾丁質(zhì)合成酶來(lái)干擾真菌細(xì)胞壁的形成，具有較高的抗菌活性;另一類是?；孱悾ǔx脲、滅幼脲、氟蟲脲等(楊化恩等，2007;趙新筠等，2003)，此類殺蟲劑安全、高效且高選擇，能夠合理、有效的控制害蟲。

同幾丁質(zhì)合成酶類似，PO 也是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的關(guān)鍵酶，在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都需要一定量的PO 來(lái)協(xié)調(diào)完成生理、形態(tài)等變化;PO 也是昆蟲免疫、防御系統(tǒng)的重要組成部分，可作為害蟲控制的一個(gè)作用靶標(biāo)，通過(guò)抑制昆蟲酚氧化酶的活力，使害蟲喪失防御能力從而間接達(dá)到合理控制蟲害的目的(羅萬(wàn)春和薛超彬，2010)。因而，酚氧化酶抑制劑有可能成為繼幾丁質(zhì)合成酶抑制劑之后一類新的對(duì)環(huán)境友好的害蟲抑制劑。

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