陳 偉，徐衛(wèi)華

(1.廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275)

Wnt 信號(hào)通路是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，它是一條與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)通路(MacDonald et al.，2009)。Wnt 信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)動(dòng)物的胚胎發(fā)育和一些疾病相關(guān)的生理過(guò)程(Clevers and Nusse，2012)。Wnt 蛋白是Wnt 信號(hào)通路中的上游因子，Wnt 家族成員眾多，迄今發(fā)現(xiàn)約100 個(gè)Wnt 家族成員(Guder et al.，2006)。自分泌或旁分泌的Wnt配體通過(guò)與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，將細(xì)胞間的信號(hào)向下進(jìn)行傳導(dǎo)。根據(jù)傳導(dǎo)過(guò)程中是否依賴于β-catenin 蛋白，可以分為經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路。經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路也被稱為依賴于β-catenin 的通路或Wnt/β-catenin通路，該通路通過(guò)β-catenin 與TCF/LEF (T 細(xì)胞因/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)合因子)結(jié)合而活化下游靶基因的轉(zhuǎn)錄(Korinek et al.，1997;Jho et al.，2002);非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路即不依賴于β-catenin 的信號(hào)通路，又包括Wnt/Ca2+通路和Wnt/平面細(xì)胞極性 (PCP)通 路 (Katoh，2005;Wang et al.，2010)。

Wnt1 是最早發(fā)現(xiàn)的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的配體，參與經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路 (Nusse and Varmus，1992)。Wnt1 配體與Fzd-LRP5/6 (卷曲蛋白-低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5/6)受體復(fù)合物結(jié)合導(dǎo)致LRP5/6 被磷酸化 (Dijksterhuis et al.，2014)，最終使得胞質(zhì)β-catenin 的穩(wěn)定和積累并進(jìn)入細(xì)胞核。核內(nèi)β-catenin 可以作為轉(zhuǎn)錄共活化因子與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 結(jié)合，從而活化下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已知Wnt/β-catenin 信號(hào)調(diào)節(jié)的下游靶基因有80 多個(gè)，如參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的c-myc 和cyclin D1、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的Myf5 和Runx2 等(MacDonald，2009;Clevers and Nusse，2012)。

Wnt1 的研究起步較早，關(guān)于其功能研究已有較多報(bào)道。然而，Wnt1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很少有報(bào)道。本研究以棉鈴蟲(chóng)Helioverpa armigera 為研究對(duì)象，在前期研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的活性在滯育蛹腦中受到抑制，Wnt1 基因的表達(dá)下調(diào)(Chen and Xu，2014)。然而，棉鈴蟲(chóng)滯育過(guò)程中Wnt1 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不明了。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，試圖從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)查Wnt1 基因的表達(dá)調(diào)控，以期為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在棉鈴蟲(chóng)滯育過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)

棉鈴蟲(chóng)為本課題組所飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為25℃，14L∶10D，飼以人工配置飼料。

1.2 菌株、細(xì)胞、載體、試劑和引物

大腸桿菌Escherichia coli DH5α 為本實(shí)驗(yàn)室保存;基因組步移試劑盒購(gòu)自Clontech 公司;啟動(dòng)子活性分析試劑盒、phRL-TK 質(zhì)粒及pGL3-basic質(zhì)粒購(gòu)自Promega 公司;pMD18-T 載體、Taq DNA polymerase 及限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司;DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;胎牛血清和Grace's 昆蟲(chóng)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司。其它試劑均為分析純(A.R.)。

本研究所用的引物交由由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 基因組DNA 的提取

取5 頭棉鈴蟲(chóng)蛹置于研缽，倒入液氮迅速冷凍后研成粉末，加入15 mL Nucleic Buffer 懸浮樣品，用紗布過(guò)濾后再加入15 mL Nucleic Buffer 沖洗紗布，濾液離心后棄上清后重懸沉淀，用3 mL Extraction Buffer 重懸，加入160 μL 10% SDS 輕輕顛倒幾次，加入6 μL RNA 酶孵育1 h，加入15 μL蛋白酶K 孵育1 h 后離心，將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的EP 管，先后加入等體積的水飽和酚，酚/氯仿及氯仿并離心，最后將上清轉(zhuǎn)至新EP 管，透析后保存于4℃。

1.4 染色體步移庫(kù)的構(gòu)建

步移庫(kù)的構(gòu)建采用Dra I、EcoR V、Pvu II 和Stu I 四種平頭末端內(nèi)切酶。構(gòu)建的步驟簡(jiǎn)述如下:EP 管中加入2.5 μg 基因組DNA、8 μL 內(nèi)切酶，10 μL 酶切Buffer，最后用水補(bǔ)充至總體積100 μL，混勻，37℃反應(yīng)過(guò)夜后取2 μL 進(jìn)行電泳檢測(cè)，DNA 彌散帶在1000 bp 左右較為合適。加入等體積的水飽和酚并輕微震蕩，室溫放置20 min，離心后吸取上清，加入等體積的氯仿并輕微震蕩，離心后吸取上清，在上清中加入2.5 倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，0.1 倍體積的3 M 乙酸鈉(pH 4.5)和20 μg糖原;輕微震蕩后離心，棄上清，加入1 mL 80%的乙醇，顛倒幾次;離心，棄上清，室溫干燥后用20 μL TE 溶解;吸取4 μL (其余的可以于-80℃保存?zhèn)溆?，加入2 μL 接頭和6 μL SolutionI(TaKaRa)，16℃連接過(guò)夜，70℃水浴5 min 后稀釋約20 倍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物，正向引物帶KpnI 酶切位點(diǎn)(具體序列及說(shuō)明見(jiàn)表1)，反向引物公用，其序列為GACAAGCTTCGGTCCTCAGATACATGAGC (下劃線為HindIII 酶切位點(diǎn))。PCR 擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的Wnt1 啟動(dòng)子片段。啟動(dòng)子片段與載體pGL3-basic用KpnI 和HindIII 雙酶切后連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR 鑒定后進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

HzAm1 細(xì)胞是來(lái)源于美洲棉鈴蟲(chóng)Helioverpa zea卵巢的一種半貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Grace's 昆蟲(chóng)培養(yǎng)基。在不含CO2的27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度約90%時(shí)可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，槍頭吸棄培養(yǎng)基，加入27℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基，將貼壁的細(xì)胞吹起，吹打混勻后按1∶3 的比例稀釋傳代，約一周可以生長(zhǎng)至90%的密度。

1.7 啟動(dòng)子活性分析

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HzAm1 細(xì)胞鋪板于96 孔板。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加入100 μg 內(nèi)參質(zhì)粒phRL-TK 和200 μg 不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h 后吸棄培養(yǎng)基，用PBS 洗凈細(xì)胞表面的培養(yǎng)基，加入50 μL 裂解緩沖液PLB，室溫震蕩20-30 min 后將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)至分析用白板，加90 μL 底物一(LAR II)，測(cè)定啟動(dòng)子片段的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)，測(cè)定的程序?yàn)?振2 s、延遲2 s，測(cè)值10 s;然后加入90 μL 底物二(Stop ＆ Glo reagent)，測(cè)定內(nèi)參質(zhì)粒phRL-TK的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)，測(cè)定程序同上。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

啟動(dòng)子活性數(shù)值測(cè)完后，用內(nèi)參質(zhì)粒phRL-TK 的相對(duì)發(fā)光單位進(jìn)行校正，以排除轉(zhuǎn)染效率的不穩(wěn)定所引起的誤差。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用SPSS 軟件，采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)兩兩比較，進(jìn)行顯著性分析。

表1 本研究所用到的正向引物Table 1 Forward primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲(chóng)基因組的提取

按照1.3 的方法，提取棉鈴蟲(chóng)的基因組DNA。利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，其A260/A280比值約1.9。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，基因組片段保持在10 kb 以上，且完整性好，條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖1)。這說(shuō)明所提取的基因組質(zhì)量較好，可以用于染色體步移庫(kù)的構(gòu)建。

圖1 基因組DNA 的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR genomic DNA by agarose gel electrophoresis

2.2 棉鈴蟲(chóng)Wnt1 基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)已有的棉鈴蟲(chóng) Wnt1 的 cDNA 序列(GenBank 登錄號(hào):KJ206240)，設(shè)計(jì)引物，與試劑盒提供的通用引物進(jìn)行巢式PCR。最后擴(kuò)增獲取了一段長(zhǎng)為1566 bp 的Wnt1 基因啟動(dòng)子片段(圖2)。

圖2 Wnt1 啟動(dòng)子序列Fig.2 Sequence of Wnt1 promoter

2.3 啟動(dòng)子活性分析

設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建包含不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子區(qū)域的重組質(zhì)粒(本研究重組質(zhì)粒的PCR 鑒定見(jiàn)圖3)。具體研究過(guò)程中，首先將三個(gè)不同長(zhǎng)度(-1566～+46，-985～+46 和-388～+46)的啟動(dòng)子片段構(gòu)建到pGL3-basic 報(bào)告質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后，與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 共轉(zhuǎn)染HzAM1 細(xì)胞。結(jié)果如圖4A 所示，隨著啟動(dòng)子長(zhǎng)度增加，活性明顯增強(qiáng)，這說(shuō)明-388～-985和-985～-1566 區(qū)域有明顯的轉(zhuǎn)錄激活。

為了進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，我們繼續(xù)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行逐步截取。在-388～-985 區(qū)域截取了3 個(gè)片段:-692～+46，-832～+46 以及-875～+46，結(jié)果熒光素酶活性分析表明，隨著啟動(dòng)子長(zhǎng)度增加，其轉(zhuǎn)錄活性逐步增加，但并不明顯(圖4B)。

圖3 重組質(zhì)粒的菌落PCR 鑒定Fig.3 PCR identification ofthe recombinant plasmids

圖4 Wnt1 啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄活性分析Fig.4 Transcriptional activity of different Wnt1 promoters

在-985～-1566 區(qū)域也截取了2 個(gè)片段:-1050～+46 和-1200～+46，結(jié)果-1050～-1200 這個(gè)區(qū)域存在非常明顯的轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)約6 倍 (圖4C)。為了確定-1050～-1200 區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活序列，再次截取了3 個(gè)片段:-1077～+46，-1120～+46 以及-1140～+46。熒光素酶活性分析表明，在-1077～-1120以及-1120～-1140 這兩個(gè)較短的區(qū)域均存在顯著的轉(zhuǎn)錄激活:相比-1077～+46，-1120～+46的轉(zhuǎn)錄活性約增強(qiáng)了4 倍，而-1140～ +46 比-1120～+46 的轉(zhuǎn)錄活性約高2 倍(圖4D)。

2.4 轉(zhuǎn)錄激活因子預(yù)測(cè)

將-1070～-1120 區(qū)域和-1120～-1140 區(qū)域序列提交TFSEARCH 網(wǎng)站進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，結(jié)果這兩個(gè)區(qū)域之間，預(yù)測(cè)得分在85 分以上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)如圖5 所示:在-1070～-1120區(qū)域包含較多的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中得分較高的有Adf-1 和ADR1。在-1120～-1140 區(qū)域，得分在85 分以上的僅有stuAp。當(dāng)然，在上述預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子中，對(duì)Wnt1 啟動(dòng)子的激活起關(guān)鍵作用的有哪些尚需進(jìn)一步的深入研究。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，也稱為Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，其信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中依賴于β-catenin 蛋白。當(dāng)細(xì)胞周?chē)h(huán)境存在特定的Wnt 配體時(shí)，通路被活化，經(jīng)過(guò)一系列的分子信號(hào)傳遞，最終激活眾多下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括c-Myc、cyclin D 等(Shtutman et al.，1999;MacDonald，2009)。

Wnt 家族成員眾多，迄今已發(fā)現(xiàn)約100 個(gè)，其中部分成員可以活化經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，如Wnt1、Wnt10b 和Wnt3a 等(Katoh，2002)。經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的研究成果主要來(lái)源于對(duì)果蠅的研究(Wodarz and Nusse，1998)，在果蠅中Wnt1 參與調(diào)節(jié)經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，介導(dǎo)果蠅早期發(fā)育的一系列重要事件。

圖5 Wnt1 啟動(dòng)子激活區(qū)域預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig.5 Predicted sites for transcription factor binding of Wnt1 promoter

棉鈴蟲(chóng)是一種危害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，廣泛分布在世界各地，每年給全球農(nóng)業(yè)造成大量損失(Xu，2008)。在中國(guó)，黃河流域和長(zhǎng)江流域的作物受棉鈴蟲(chóng)的危害較重。棉鈴蟲(chóng)適應(yīng)環(huán)境的能力強(qiáng)，滯育是其適應(yīng)惡劣外界環(huán)境的重要策略。對(duì)棉鈴蟲(chóng)滯育機(jī)制的研究可以為棉鈴蟲(chóng)的蟲(chóng)害防治提供新的思路和對(duì)策。

前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路在棉鈴蟲(chóng)滯育蛹腦中受到抑制，該通路相關(guān)的多個(gè)重要基因如Wnt1，β-catenin 以及c-myc 等的表達(dá)均下調(diào)(Chen and Xu，2014;陳偉和徐衛(wèi)華，2015)。由于Wnt1 配體對(duì)整個(gè)通路的活化起著至關(guān)重要的作用，對(duì)Wnt1 基因的表達(dá)調(diào)控研究有利于我們了解經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路受到抑制的原因。本研究以Wnt1 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控為研究目標(biāo)，對(duì)Wnt1 啟動(dòng)子的活性進(jìn)行了分析。

首先構(gòu)建了棉鈴蟲(chóng)染色體步移庫(kù)，克隆了一段棉鈴蟲(chóng)Wnt1 啟動(dòng)子片段。該啟動(dòng)子片段的平均AT 含量為65.62%，部分區(qū)域AT 含量過(guò)高，如73.6% (-490～-812)，76.27% (-924～-1062)以及78.57% (-255～-437)，且堿基分布嚴(yán)重不均勻，連續(xù)五個(gè)以上的同一堿基出現(xiàn)的概率較高。上述原因?qū)е聠?dòng)子的克隆遇到較多的問(wèn)題，本研究所獲取的啟動(dòng)子序列是三次步移序列拼接的結(jié)果。獲取序列后，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行逐步截短并分析其活性，最終將轉(zhuǎn)錄激活區(qū)鎖定到-1077～-1120 以及-1120～-1140 這兩個(gè)較小的區(qū)域。對(duì)這兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有較多潛在的轉(zhuǎn)錄因子可能參與Wnt1 基因的激活，如Adf-1，ADR1，Sp1 以及stuAp 等等，然而具體哪些轉(zhuǎn)錄因子在Wnt1 基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，尚需作進(jìn)一步的研究。有可能這些轉(zhuǎn)錄因子的活性在滯育蛹腦中下調(diào)，從而在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)Wnt1 基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，-1200～-1140 區(qū)域以及-1566～-1200 區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控是分子生物學(xué)中一個(gè)有趣的現(xiàn)象，其機(jī)制更為復(fù)雜，涉及到DNA 構(gòu)象以及蛋白質(zhì)相互作用等，這也是今后研究Wnt1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的方向。

在后續(xù)研究中，將繼續(xù)調(diào)查轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Wnt1啟動(dòng)子活性的作用，為從根本上了解經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路在滯育蛹腦的調(diào)節(jié)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

References)

Chen W，Xu WH.Wnt/β-catenin signaling regulates Helicoverpa armigera pupal development by up-regulating c-Myc and AP-4［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2014，53:44-53.

Chen W，Xu WH.Preparation of polyclonal antibody and expression analysis of β-catenin in pupal brains from Helicoverpa armigera［J］.Journal of Environmental Entomology，2015，37 (3):551-557.［陳偉，徐衛(wèi)華.棉鈴蟲(chóng)β-catenin 的多克隆抗體制備及在蛹腦中的表達(dá)研究［J］.環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2015，37 (3):551-557］

Clevers H，Nusse R.Wnt/β-catenin signaling and disease［J］.Cell，2012，149 (6):1192-1205.

Dijksterhuis JP，Petersen J，Schulte G.WNT/Frizzled signalling:receptor-ligand selectivity with focus on FZD-G protein signalling and its physiological relevance:IUPHAR Review 3 ［J］.British Journal of Pharmacology，2014，171 (5):1195-1209.

Guder C，Philipp I，Lengfeld T，et al.The Wnt code:cnidarians signal the way［J］.Oncogene，2006，25 (57):7450-7460.

Jho E，Zhang T，Domon C，et al.Wnt/β-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2，a negative regulator of the signaling pathway ［J］.Molecular and Cellular Biology，2002，22 (4):1172-1183.

Katoh M.WNT and FGF gene clusters［J］.International Journal of Oncology，2002，21 (6):1269-1273.

Katoh M.WNT/PCP signaling pathway and human cancer ［J］.Oncology Reports，2005，14 (6):1583.

Korinek V，Barker N，Morin PJ，et al.Constitutive transcriptional activation by a β-catenin-Tcf complex in APC-/-coloncarcinoma［J］.Science，1997，275 (5307):1784-1787.

MacDonald BT，Tamai K，He X.Wnt/β-catenin signaling:components，mechanisms，and diseases［J］.Developmental Cell，2009，17 (1):9-26.

Nusse R，Varmus HE.Wnt genes［J］.Cell，1992，69 (7):1073-1087.

Shtutman M，Zhurinsky J，Simcha I，et al.The cyclin D1 gene is a target of the β-catenin/LEF-1 pathway［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1999，96 (10):5522-5527.

Wang Q，Symes AJ，Kane CA，et al.A novel role for Wnt/Ca2+signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer［J］.PLoS ONE，2010，5 (5):e10456.

Wodarz A，Nusse R.Mechanisms of Wnt signaling in development［J］.Annual Review of Cell and Developmental Biology，1998，14 (1):59-88.

Xu WH.Advances in insect diapause ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2008，45 (4):512-517.［徐衛(wèi)華.昆蟲(chóng)滯育研究進(jìn)展［J］.昆蟲(chóng)知識(shí).2008，45 (4):512-517］