狄雪塬，楊茂發(fā)，3*，鄒 曉

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025;2.貴州大學(xué)真菌資源研究所，貴陽 550025;3.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴陽 550025)

稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel 原產(chǎn)北美，19 世紀(jì)隨著密西西比河流域水稻大規(guī)模種植而轉(zhuǎn)入稻田危害，并逐漸成為水稻的毀滅性害蟲(Zou et al.，2004)，1988年傳至中國，是我國重要的檢疫害蟲，其成蟲取食水稻的細(xì)嫩部分，影響水稻的光合作用，幼蟲危害根部，阻礙養(yǎng)分傳輸，使水稻苗生長速度減緩，植株矮化，分蘗能力下降，最終導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降，一般造成減產(chǎn)10%-30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50% 以上，甚至絕收(Zou et al.，2004)。

目前對稻水象甲的防治主要以化學(xué)防治為主(蔡明等，2000)，化學(xué)藥劑可以在短時(shí)間內(nèi)控制蟲口的數(shù)量，但農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致稻水象甲抗藥性問題日趨嚴(yán)重，并帶來了防治成本的增加和生態(tài)系統(tǒng)惡化等一系列問題(Saito et al.，2005)。生物防治是基于生態(tài)平衡的原理，利用天敵的作用來調(diào)節(jié)有害生物種群密度，使之長期穩(wěn)定在不危害的水平(蔡明等，2003)，但原產(chǎn)于北美洲的天敵并沒有隨之傳入，因此稻水象甲的天敵匱乏，生物防治研究進(jìn)展甚微(于風(fēng)泉等，2003)。

20 世紀(jì)80年代，日本學(xué)者致力于尋找其天敵，研究得出只有綠僵菌和白僵菌對成蟲具有較強(qiáng)的致病性，可被作為微生物防治的材料(Nagano，1987;Yozhlzawa，1993)。球孢白僵菌是一種致病性強(qiáng)、寄主范圍廣、適應(yīng)性廣的昆蟲病原真菌，可侵染15 目149 科的700 余昆蟲，因其還具有不污染環(huán)境、無公害、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在生物防治中日益受到關(guān)注(岡田齊夫和馬桂椿，1984)。20 世紀(jì)80年代以來，國內(nèi)學(xué)者開展了較多的利用球孢白僵菌防治稻水象甲的試驗(yàn)研究(李增智，1996;蔣明星等，2002;于鳳泉等，2003;徐進(jìn)等，2013;關(guān)志堅(jiān)等，2014)，篩選了一些致病力強(qiáng)的菌株，并在田間應(yīng)用上表現(xiàn)出良好的防效。球孢白僵菌YS03 菌株系本項(xiàng)目組徐進(jìn)(2013)等篩選出的對稻水象甲成蟲致病力強(qiáng)的優(yōu)效菌株，該菌株在孢子濃度為2.0×108個(gè)/mL 接種處理后，26℃條件下第15 天供試成蟲平均校正死亡率達(dá)96.55%。為了讓YS03 菌株有效的應(yīng)用于稻水象甲的防控實(shí)踐中，我們對其培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了初步探索，旨在研究出原料廉價(jià)易得、制備方法簡便、營養(yǎng)能完全滿足菌種生長且方便批量生產(chǎn)的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:YS03 白僵菌菌種，由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所提供。

原料:麥麩、米糠、玉米粉、花生、面粉、燕麥、豌豆粉、百合粉等。

藥品:蛋白胨、葡萄糖、瓊脂等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所提供的YS03 白僵菌菌株，先將保藏的菌種接種在PDA 斜面培養(yǎng)基上于25℃及12L∶12D 條件下活化培養(yǎng)7 d 待用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

市場上購買原材料，以PDA 培養(yǎng)基中提供的營養(yǎng)成分含量(主要依據(jù)碳源和氮源)為參照，根據(jù)各材料所含營養(yǎng)成分的不同，每種材料設(shè)計(jì)3個(gè)梯度，各梯度原材料加水1000 mL，煮沸20-30 min，用紗布過濾，加水至1000 mL，再加入30 g 瓊脂，加熱讓其充分溶解即可。

1.2.3 培養(yǎng)基單因素篩選實(shí)驗(yàn)

將制備好的培養(yǎng)基滅菌然后倒平板，編號，待其冷卻凝固，將之前培養(yǎng)好的YS03 白僵菌用直徑1 cm 的打孔器打孔，接在培養(yǎng)皿上，每皿接3孔，25℃培養(yǎng)，48 h 后第一次觀察并記錄菌落直徑及生長狀態(tài)，之后每24 h 觀察一次，觀察7 d，然后用血球計(jì)數(shù)法測量各培養(yǎng)基的孢子量。

1.2.4 培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素結(jié)果利用Box-Behnken 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共有17 組試驗(yàn)，把每組試驗(yàn)的不同配方按比例稱好，培養(yǎng)基的制備同1.2.2，觀察方法同1.2.3。將得出的結(jié)果輸入Design-Expert 8.0 中進(jìn)行響應(yīng)面分析，從而優(yōu)化培養(yǎng)基的組分，獲得最佳配方。

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過Design-Expert 8.0 的響應(yīng)面分析得出一個(gè)最佳配方，重復(fù)以上培養(yǎng)基的制備和試驗(yàn)方法，以PDA 培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的單因素實(shí)驗(yàn)

8種單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，方差分析，得到各因素之間差異顯著，多重比較選出對YS03 球孢白僵菌產(chǎn)孢量影響比較大的三種原料:花生50 g，麥麩150 g，玉米粉200 g，從而篩選出花生、麥麩、玉米粉三種配料作為制備培養(yǎng)基的基礎(chǔ)原料。

2.2 培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取花生、麥麩、玉米粉對YS03 球孢白僵菌產(chǎn)孢量影響較大的三個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)的各因素水平見表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3，其中12 組為析因試驗(yàn)，5 組為重復(fù)的中心點(diǎn)試驗(yàn)，用于考察模型的誤差。

表1 不同濃度產(chǎn)孢量的方差分析Table 1 Analysis of variance (ANOVA)for different concentration of spore yields

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of RAS test

表3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results

(續(xù)上表)

2.2.2 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得出多元線性模型回歸結(jié)果:Y=-3.96258×108+5.54067×106X1+1.731×106X2+5.273×105X3+2.04×104X1X2-2.49×104X1X3+1.92×104X2X3-4.104×104X12-3.05×104X22-2.97×104X32，其中X1、X2、X3分別是花生、麥麩和玉米粉，Y值為產(chǎn)孢量。對該二項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行方差分析，見表3。該模型方程具有顯著差異。失擬差不顯著，表明方程的擬合不足實(shí)驗(yàn)不顯著，沒有明顯失擬因素存在，對模型是有利的。因此，該模型可以用于對YS03 球孢白僵菌的產(chǎn)孢量進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4 產(chǎn)孢量回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA)for regression equation

2.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化條件的確定

為了進(jìn)一步探索X1、X2、X3的交互作用對響應(yīng)值Y 的影響，采用Design-Expert 軟件繪制了等高線圖及對應(yīng)的三圍響應(yīng)曲面圖。圖1-3 為分別固定三個(gè)影響因素之一，考察其他兩個(gè)因素對響應(yīng)值影響的曲面圖，圖底部平面為等高線，等高線圖的重合區(qū)域用來進(jìn)行各影響因素的優(yōu)化。等高線的形狀和線間的疏密程度均能反應(yīng)出兩變量間交互作用的大小，橢圓形、線間密度大的表示交互作用大，圓形、線間密度小的表示交互作用小;響應(yīng)面曲面傾斜度大表示交互作用大，響應(yīng)面曲面傾斜度小表示交互作用小 (雷欣宇等，2013)。由圖1-3 分析可得，兩兩因素之間對響應(yīng)值Y 均有一定的交互作用，其中花生和玉米粉的交互作用最為顯著。

圖1 為X2(麥麩)在0 水平時(shí)，X1(花生)與X3(玉米粉)交互作用的等高線圖及相應(yīng)響應(yīng)面圖。由圖可知，當(dāng)X1值一定時(shí)，隨著X3值在一定范圍內(nèi)增加，響應(yīng)值Y 也隨之增加，在X3取值在85-105 范圍內(nèi)，Y 達(dá)到最大值，但當(dāng)X1繼續(xù)增加時(shí)，Y 值則會(huì)下降。說明玉米粉的含量在一定范圍內(nèi)會(huì)增加白僵菌的產(chǎn)孢量，但超過這個(gè)范圍，便會(huì)抑制產(chǎn)孢量。當(dāng)X3值一定時(shí)，隨著X1值得增加，Y 值也是先上升后下降，X1取值范圍為45-105 時(shí)，產(chǎn)孢量最大，X1值過高過低都不利于白僵菌的產(chǎn)孢量。

同理，由圖2、圖3 分析可得，當(dāng)X1值一定時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到最大值時(shí)，X2的取值范圍為78-80，當(dāng)X2值一定時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到最大值時(shí)，X1的取值范圍為55-65;當(dāng)X2值一定時(shí)，X3取值范圍在85-105 時(shí)，產(chǎn)孢量可達(dá)到最大響應(yīng)值區(qū)域，當(dāng)X3值一定時(shí)，X2取值范圍在70-80 時(shí)，產(chǎn)孢量可達(dá)到最大響應(yīng)值區(qū)域。

根據(jù)Box-Behhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，優(yōu)化的最終結(jié)果為:花生59.59 g，麥麩76.08 g，玉米粉88.33 g，這個(gè)最佳配方產(chǎn)孢量的預(yù)測值為6.76×107個(gè)/mL。

圖1 花生與玉米粉交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.1 Response surface and contour plot showing the interactive effects of peanut and maizena on the spore yields

圖2 花生與麥麩交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of peanut and bran on the spore yields

圖3 麥麩與玉米粉交互作用響應(yīng)面圖等高線圖Fig.3 Response surface and contour plot showing the interactive effects of bran and maizena on the spore yields

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性及優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的效果，對優(yōu)化后的培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基(PDA)分別進(jìn)行產(chǎn)孢量測定試驗(yàn)，優(yōu)化培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量為6.15×107個(gè)/mL，其實(shí)際試驗(yàn)值與模型預(yù)測值6.76×107個(gè)/mL 基本一致，說明此配方是可靠的。對照培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量為3.2×107個(gè)/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)孢量是對照組產(chǎn)孢量的1.92 倍。

3 結(jié)論與討論

球孢白僵菌是一種重要昆蟲病原真菌，已經(jīng)用于多種農(nóng)林害蟲的微生物防治 (羅成等，2011)，徐進(jìn)等(2013)篩選出了對稻水象甲的致病力強(qiáng)的優(yōu)效球孢白僵菌YS03 菌株，本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)得出使YS03 球孢白僵菌產(chǎn)孢量最大的培養(yǎng)基配方為花生∶麥麩∶玉米粉=2.6∶3.5∶3.9。

前人對培養(yǎng)基的篩選做了很多工作，篩選出葡萄糖2%、牛肉蛋白胨1%、牛肉浸膏0.3% 和K2HPO41%為嗜線蟲致病桿菌HB310 培養(yǎng)基的最佳配方 (王永娟等，2014);葡萄糖3.2%、CaCO30.84%和番茄33%為嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基的最佳配方(雷欣宇等，2013)，這些均是對細(xì)菌培養(yǎng)基的優(yōu)化，而對球孢白僵菌培養(yǎng)基的篩選及優(yōu)化，徐文靜等 (2006)實(shí)驗(yàn)表明球孢白僵菌在L-broth 培養(yǎng)基上生長最快;王韜遠(yuǎn)等 (2013)研究得出，在PPDA 培養(yǎng)基中添加70 mg/L 的多果定，125 mg/L 頭孢霉素和138 mg/L 硫酸卡那霉素為球孢白僵菌最適培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基的優(yōu)化都是基于已有培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的，而本實(shí)驗(yàn)則是利用簡單易得的農(nóng)副產(chǎn)品篩選出適合球孢白僵菌YS03 菌株生長的培養(yǎng)基配方，且其產(chǎn)孢量并不低于已有培養(yǎng)基。

王濱等(2000)做球孢白僵菌選擇性培養(yǎng)基的篩選時(shí)，篩選出燕麥培養(yǎng)基對球孢白僵菌生長有利而對其它雜菌有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，燕麥培養(yǎng)基菌落生長和產(chǎn)孢量都不理想，幾乎沒有雜菌出現(xiàn)，這一現(xiàn)象與王濱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。徐文靜等(2006)以菌落直徑為觀測值得出PDA 培養(yǎng)基要優(yōu)于花生培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)孢量為觀測值，花生培養(yǎng)基要優(yōu)于PDA 培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)的花生培養(yǎng)基與徐文靜實(shí)驗(yàn)中的花生培養(yǎng)基成分不同，且觀測的生物學(xué)特性不同，可能還存在別的原因，有待進(jìn)一步探討。

從響應(yīng)面分析圖中可看出，每種配料都是在一定范圍內(nèi)產(chǎn)孢量會(huì)達(dá)到最高值，隨著配料的繼續(xù)增加，產(chǎn)孢量反而會(huì)減少，說明白僵菌對不同營養(yǎng)的需求是有一定比例的，過高過低都不能使菌株很好的生長，只有配料比例適當(dāng)才能更好更快的培養(yǎng)白僵菌。

鄺灼彬等(2005)在最適溫度下，得到的球孢白僵菌的最高產(chǎn)孢量達(dá)6.40×107個(gè)/mL，齊永霞等(2011)實(shí)驗(yàn)中球孢白僵菌最高產(chǎn)孢量為5.42×107個(gè)/mL。本試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳配方使白僵菌的產(chǎn)孢量達(dá)到6.15×107個(gè)/mL，與其他研究者產(chǎn)孢量的差異可能由于培養(yǎng)條件和菌株差異引起的，試驗(yàn)中對照培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量僅為3.2×107個(gè)/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)孢量是對照組(PDA)產(chǎn)孢量的1.92 倍，且優(yōu)化后的培養(yǎng)基要優(yōu)于任何單一培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基能增加產(chǎn)孢量，其配方能較好的滿足規(guī)?；囵B(yǎng)白僵菌的需要，且配方材料簡單易得，該研究具有較好的應(yīng)用前景。

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