何 琪，邰先桃，張星賀，董美辰

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650500）

腦性癱瘓（Cerebral palsy，CP）簡稱腦癱，是一組持續(xù)存在的中樞性運動和姿勢發(fā)育障礙、活動受限癥候群，這種癥候群是由于發(fā)育中的胎兒或嬰幼兒腦部非進行性損傷所致。患兒還常伴發(fā)許多其他的障礙，如感覺、知覺、認(rèn)知、交流、和行為障礙，以及癲癇和繼發(fā)性肌肉、骨骼問題[1].在發(fā)達國家新生兒CP發(fā)病率為2‰，甚至更高[2]，我國腦癱發(fā)病率有逐年增多的趨勢[3]。CP 不僅嚴(yán)重影響了患兒的正常生長發(fā)育、社會交往、學(xué)習(xí)和生存的能力，而且造成了家庭和社會的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，是一個重大的衛(wèi)生經(jīng)濟問題。目前CP 的發(fā)病機制尚未完全，也無相應(yīng)的有效的治療策略。為了對該CP 進行有效的預(yù)防和診斷治療，研究并明確CP 發(fā)生發(fā)展機制至關(guān)重要，而有效而實用的CP 動物模型的制備是前提。因此，本文從CP 動物模型的制作和評估方法兩方面進行綜述。

1 CP 模型動物的選擇

目前，國內(nèi)外報道的運用于CP 模型的動物主要有羊、豬、兔和鼠等。腦白質(zhì)損傷（White matter injury，WMI）是腦損傷的主要病理變化之一，能導(dǎo)致髓鞘損傷和神經(jīng)纖維不能髓鞘化等，從而導(dǎo)致CP患兒慢性神經(jīng)功能障礙[4]，發(fā)育中的大腦在缺氧缺血時特別容易形成腦白質(zhì)的損傷，而胎羊的腦白質(zhì)發(fā)育在生理和解剖方面與人類有很多共通之處，從而為研究復(fù)雜的人類腦損傷的病理生理過程提供了途徑[5]。

新生豬在生長發(fā)育、血液循環(huán)、新陳代謝等各方面與新生兒相似。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，新生豬在出生7d內(nèi)，大腦的發(fā)育成熟度與人類新生兒相近，在磁共振頻譜分析上，新生豬的波峰特點也與人類新生兒相吻合，因此我們可以選用新生豬來作為實驗動物，模擬人類新生兒大腦缺氧缺血性時的病理變化[6]。

大鼠神經(jīng)解剖與人類極為接近[7]，且鼠的大小合適、繁殖能力強、抗感染能力強、實驗方便和比較經(jīng)濟；大鼠腦組織體積小，便于取材，進行病理切片的觀察，同時，大鼠情緒反應(yīng)較為敏感，便于進行神經(jīng)行為學(xué)觀察。由于胎羊和新生豬等大型動物不易獲得、易死亡、費用昂貴和飼養(yǎng)條件受到限制等原因，目前大多選用鼠做為實驗CP 模型動物。

2 CP 模型造模方法

小兒CP 的病因常被總結(jié)為窒息、早產(chǎn)和核黃疸等因素[8]。目前CP 模型的造模方法基本可分為頸總動脈結(jié)扎法、宮內(nèi)感染法、神經(jīng)毒素法、宮內(nèi)缺氧缺血法等。

2.1 頸總動脈結(jié)扎法

缺氧缺血是CP 發(fā)生的常見病因。典型的缺氧缺血CP 模型的操作有：參照Adem 等[9-10]的建模方法，使用出生滿7d 的健康Wistar 幼鼠進行模型制備，首先吸入異氟醚麻醉后，用濃度為75%乙醇消毒頸部皮膚，在手術(shù)顯微鏡下于頸正中行一長約0.5cm 的縱行切口，然后分離皮下組織和淺筋膜等，頸總動脈位于右側(cè)頸動脈三角內(nèi)，在找到頸動脈和伴行的迷走神經(jīng)后，將其小心分離，接著以絲線雙重結(jié)扎右側(cè)頸總動脈并離斷，最后縫合頸部皮膚切口。術(shù)后麻醉恢復(fù)2h 后，將模型幼鼠放置在由8%O2和92%N2的混合氣體造成的缺氧環(huán)境中，時間為2h。隨后在不同的時間點對實驗動物采用動物行為學(xué)試驗如平衡木試驗和足印分析等，運動誘發(fā)電位及病理檢測等來驗證CP 模型。缺氧可導(dǎo)致腦血流增加，但白質(zhì)區(qū)不如灰質(zhì)區(qū)明顯，腦血流量增加導(dǎo)致代償能量利用，因此缺氧可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦白質(zhì)損害。在胚胎早期缺血可引起腦發(fā)育畸形，胚胎后期可發(fā)生破壞，如孔洞腦、腦軟化癥和無腦性腦積水等，缺氧缺血發(fā)生在圍生期可造成腦梗死、腦出血等嚴(yán)重?fù)p傷。

但是也有部分報道稱該方法更易引起灰質(zhì)的損傷而非白質(zhì)，進而提出了雙側(cè)頸總動脈切斷的模型，然而，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的動物存活率低于單側(cè)頸總動脈結(jié)扎的存活率[11]。單側(cè)頸總動脈結(jié)扎法經(jīng)過多番驗證被認(rèn)為是一種可靠且穩(wěn)定的模型[12]。

2.2 宮內(nèi)感染法

WMI 是早產(chǎn)兒腦損傷最常見的類型，腦白質(zhì)損傷產(chǎn)生的原因復(fù)雜，但炎癥反應(yīng)在腦白質(zhì)損傷中產(chǎn)生的作用在近幾年來受到較大重視[13]。近年來，大量研究表明圍產(chǎn)期感染，如絨毛膜羊膜炎和胎兒血管炎不僅是早產(chǎn)的重要原因，同時與早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)生密切相關(guān)[14]。采取孕鼠腹腔內(nèi)或子宮頸內(nèi)注射脂多糖，以建立CP 模型，最為常見，應(yīng)用最廣泛。

2.2.1 腹腔內(nèi)注射法

李曉婕等[15]將國外學(xué)者的腹腔內(nèi)注射建立CP模型的方法加以改進，主要步驟有：將24 只Wistar孕鼠分為2 組，實驗組16 只，對照組8 只，實驗組每天注射1 次脂多糖，每次為350μg/kg，連續(xù)注射2d，對照組則腹腔注射同劑量的生理鹽水。觀察孕鼠的分娩時間并記錄新生鼠出生體重，凡早于孕22d 出生的新生鼠均視為早產(chǎn)鼠，待新生鼠出生后立即處死分娩后的母鼠，取其子宮和胎盤，通過做HE 染色觀察宮內(nèi)感染情況來驗證CP 模型是否成功。

2.2.2 子宮頸內(nèi)注射法

邱洪斌等[16]復(fù)制CP 模型的方法是：模型動物選用成熟Wistar 大鼠，孕鼠在受孕第10 天、第15天及第20 天分別代表妊娠早、中、晚的不同時段，對其分組后給藥，給藥時先乙醚吸入麻醉孕鼠，再用陰道擴張器暴露孕鼠子宮頸，將0.1mL 脂多糖溶液用1mL 注射器注射到子宮頸肌肉內(nèi)（脂多糖溶液濃度為0.1mg/kg 孕鼠體重稱取脂多糖溶于0.1mL生理鹽水中），注射時不可將液體注入子宮腔內(nèi)，同時確保操作熟練度，每只孕鼠操作時間不得超過2min。

2.2.3 腹腔注射脂多糖合并缺氧法

高峰等[17]的CP 建模方法：選用受孕17dWistar孕鼠經(jīng)腹腔注射脂多糖，劑量為0.4mg/（kg·d），于注射12h 后將孕鼠置于由8%氧氣和92%氮氣構(gòu)成的缺氧環(huán)境中缺氧2～2.5h，待孕鼠恢復(fù)4h 后，再次腹腔注射同劑量脂多糖，最后放回籠中飼養(yǎng)，等待孕鼠自體分娩后將生下的乳鼠和母鼠同籠飼養(yǎng)。Hu 等[18]采用腹腔注射脂多糖宮內(nèi)感染合并全身缺氧的方法建立一種微創(chuàng)傷、簡單易行、成功率高、逼真模擬人類胎兒在圍產(chǎn)期缺血缺氧過程的CP 動物模型。

2.3 神經(jīng)毒素法

膽紅素血癥時，膽紅素通過血腦屏障，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病變特點在腦基底核、海馬、視丘下核和齒狀核等被感染成亮黃或深黃色。鏡下觀察上述部位的神經(jīng)細(xì)胞核小膠質(zhì)細(xì)胞不同程度變性，大量神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生替代。孫葉強等[19]的CP 建模方法是：給2 組實驗組仔兔分別腹腔注射膽紅素100 mg/kg、300 mg/kg，正常組及給藥后的實驗組由母兔自然哺育45d。通過神經(jīng)學(xué)檢查和病理性檢查，發(fā)現(xiàn)其中部分仔兔有明顯運動姿勢異常，其病理改變也同人類相似，提示腹腔注射膽紅素300 mg/kg 能造成仔兔腦損傷并致CP。

2.4 宮內(nèi)缺氧缺血法

宮內(nèi)缺氧缺血法是近幾年研究的較多的方法之一，模型動物多選用健康新西蘭白兔，Drobyshevsky等[20]的方法是選用妊娠22d 的新西蘭白兔，使用芬太尼（75μg/kg·h-1）和氟哌利多（3.75mg/kg·h-1）靜脈復(fù)合麻醉，隨后用0.75%布比卡因腰麻，沿著左側(cè)腹股溝中點切開皮膚，分離股動脈和其他軟組織后，在股動脈上做一縱行切口，由此插入一球囊導(dǎo)管，進入下行的主動脈至上段子宮動脈。期間用直腸溫度探頭監(jiān)測體溫。氣囊充氣40min，導(dǎo)致子宮缺血和隨后的宮內(nèi)胎兔全腦缺氧缺血。待缺氧缺血期結(jié)束時，將氣囊放氣，造成子宮灌注和胎兒腦組織再灌注的復(fù)氧期，最后取出導(dǎo)管，修復(fù)股動脈，使其恢復(fù)。

國內(nèi)的做法也大同小異，王能里等[21-22]則是在氣囊內(nèi)注入生理鹽水，且發(fā)現(xiàn)動脈供血阻斷的時間越長，隨之造成的腦損傷程度也不同。根據(jù)雌兔孕期長短的不同，子宮動脈血流阻斷時間也要相應(yīng)改變。孕26d 的雌兔子宮供血阻斷的時間可以長達35～37min，而孕29d 的雌兔最佳的阻斷動脈供血的時間應(yīng)該為25～28min，當(dāng)時間延長到40～50min，死胎率可以達到100%，合理的時間能控制死胎率同時造成理想的腦白質(zhì)損傷和神經(jīng)行為學(xué)的異常。

2.5 腹腔注射合并缺氧缺血法

Alexandre Savard 等[23]的模型制備方法是待孕鼠自然生產(chǎn)后，于第12 天給予乳鼠腹腔注射脂多糖（按200 μg/kg 稀釋于50μL 生理鹽水中），乳鼠恢復(fù)4h 后異氟醚麻醉進行右側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)，使用加熱墊使溫度保持在37℃，回籠休息30min 后將幼鼠置于8%O2的缺氧空間內(nèi)1.5h，溫度保持為37℃。研究發(fā)現(xiàn)將腹腔注射脂多糖與缺氧缺血相結(jié)合時，能造成更嚴(yán)重的腦損傷，并且當(dāng)缺氧時間超過3h 后，乳鼠死亡率達到最高值[24]。

2.6 其他CP 模型

除以上幾種動物模型外，還有采用電損毀錐體束建立一側(cè)肢體痙攣性CP 的模型。實驗動物選用健康SD 大鼠，大鼠腹腔麻醉后固定在大鼠腦定位儀上，電極陽極針連接定位儀備用，大鼠頭頂備皮，同時鼠尾部插入電極陰極針，在頭頂后正中行一約3cm 的切口，逐層切開，暴露前囟和矢狀縫，根據(jù)大鼠腦癱立體定位圖定位，用骨鉆穿透顱骨，再垂直刺入電極針進行電刺激，隨后拔針止血，用骨蠟封住鉆孔，最后縫合傷口[25]。由于動物模型癥狀不典型或癥狀持續(xù)時間較短，李亮等[26]采用顱內(nèi)注射無水乙醇的方法制作痙攣性CP 模型。這種方法在定位后，使用微量注射器在顱內(nèi)注射無水乙醇造成模型動物錐體束壞死，研究中發(fā)現(xiàn)注射劑量為15μL 時效果較好，能較好地模擬痙攣性CP 的生理病理改變。

3 模型評估方法

現(xiàn)有的模型評估方法主要有動物一般情況評估法、行為學(xué)評估法及病理檢測法等。

3.1 一般情況觀察

模型動物一般情況觀察主要包括間斷體重測量、幼鼠出生時及后期皮膚顏色、每日活動量等，可以反映模型動物出生及后期的生長情況。

3.2 行為學(xué)評估法

動物行為學(xué)是判斷造模成功與否的重要觀察指標(biāo)，從檢測目的來看，基本可分為感覺運動類和學(xué)習(xí)記憶類。感覺運動類即觀察動物運動發(fā)育情況，常用方法有平衡木、足印試驗、翻身實驗、懸吊實驗、斜坡實驗、旋轉(zhuǎn)試驗、圓筒試驗、曠場試驗等；學(xué)習(xí)記憶類主要包括水迷宮試驗、穿梭試驗等[27-29]。其中運用最多的主要是曠場試驗和水迷宮試驗，前者用來評估全腦結(jié)構(gòu)的完整性，后者用來評估海馬的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[30]。

3.3 病理切片鑒定法

病理切片是判斷造模成功與否最確切的證據(jù)。首先對造模成功的模型動物使用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭剝?nèi)∧X組織，放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，換蔗糖溶液至腦組織沉入瓶底，截取所需腦組織制成5μm 厚石蠟切片行HE 染色，分析切片。?？梢姷降漠惓Ｊ前踪|(zhì)與灰質(zhì)、海馬區(qū)界限不清，海馬區(qū)無規(guī)整緊實排列的單層神經(jīng)元細(xì)胞層，神經(jīng)元數(shù)量少，發(fā)育不成熟等[31]。

4 小結(jié)

研究急性和亞急性的生理和代謝機制的CP 模型多選用胎羊和新生豬等動物，而嚙齒類動物和靈長類動物多被運用于觀察長期的神經(jīng)病理學(xué)及行為學(xué)的CP 建模。宮內(nèi)缺氧缺血法的優(yōu)點在于不僅能逼真的模擬新生兒在子宮內(nèi)獲得的全腦缺氧缺血性病理損傷，并且能誘發(fā)胎兔在神經(jīng)行為學(xué)上的病理性異常改變，但其不足同子宮頸注射脂多糖的方法一樣，實驗過程復(fù)雜，加大了實驗的難度和不確定性；腹腔注射脂多糖造成宮內(nèi)感染的方法簡便易行，同樣能模擬胎兒在母體子宮內(nèi)獲得的感染，但我們在實踐過程中發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染的模型制備方法可重復(fù)性較低，難以制作出符合條件的腦癱模型，而其他的模型制作方法尚不成熟。綜上所述，最為經(jīng)典的是單側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法，該法自發(fā)表以來已被國內(nèi)外學(xué)者廣泛采用，已經(jīng)趨向成熟穩(wěn)定，且實驗簡便易行，可重復(fù)性好，是目前缺氧缺血性腦病模型優(yōu)先選擇的方法之一。在模型評估方面，無論用動物行為學(xué)還是病理切片方法，一般情況觀察的均不可少，動物行為學(xué)評估法還要根據(jù)實際需要選擇合適的行為學(xué)實驗方法。

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