徐小萍，謝燕萍，慕堯，鐘春水，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002）

6-BA 與NAA 的濃度配比對(duì)迷迭香愈傷組織生長(zhǎng)的影響

徐小萍，謝燕萍，慕堯，鐘春水，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002）

以迷迭香愈傷組織為材料，采用2因素3水平完全隨機(jī)試驗(yàn)，在含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中加入不同濃度配比的6-BA和NAA，探討不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)迷迭香愈傷組織生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，最適于迷迭香愈傷組織增殖的激素配比為0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，培養(yǎng)20 d后，增殖系數(shù)為10.98。

迷迭香；愈傷組織；BA；NAA；增殖

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）別名海洋之露，是唇形科迷迭香屬灌木，性喜溫暖氣候，原產(chǎn)于歐洲和非洲北部地中海沿岸，目前在我國(guó)南方大部分地區(qū)和山東栽種，是重要的香料作物。迷迭香作為一種新興的經(jīng)濟(jì)植物，因其含有較多的抗氧化活性物質(zhì)，如萜類中的鼠尾草酸、熊果酸，黃酮類及各種有機(jī)酸等被廣泛應(yīng)用于植物次生代謝抗氧化物的生產(chǎn)[1]。但迷迭香植株生長(zhǎng)緩慢，生物量不大，影響藥用成分的獲取。

采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行迷迭香藥用成分的生產(chǎn)是解決迷迭香生產(chǎn)緩慢的有效途徑。但關(guān)于迷迭香組織培養(yǎng)的報(bào)道，國(guó)內(nèi)外很少。福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所姚鳳琴等報(bào)道了迷迭香葉片愈傷組織的誘導(dǎo)[2]，于巧芝等報(bào)道了不同光質(zhì)對(duì)迷迭香愈傷組織生長(zhǎng)狀況的影響[3]；此外，劉明家報(bào)道了迷迭香組培材料迷迭香酸和鼠尾草酸含量的測(cè)定[1]。前人的研究中，愈傷組織的增殖條件優(yōu)化還不夠理想，關(guān)于不同激素濃度組合對(duì)愈傷組織增殖的影響還缺乏較系統(tǒng)深入的研究。姚鳳琴[2]的研究認(rèn)為，2，4-D的濃度以1.0 mg/L為宜，但對(duì)于常見激素NAA和BA對(duì)愈傷組織增殖的影響，未做比較分析。鑒于此，該試驗(yàn)在姚風(fēng)琴研究的基礎(chǔ)上，參照其他類似研究結(jié)果[1-6]，通過在含1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中添加不同濃度配比的6-BA和NAA，探究有利于迷迭香愈傷組織增殖的最佳組合，以便大量增殖迷迭香愈傷組織，為后續(xù)提取迷迭香愈傷組織中的藥

用次生代謝物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

迷迭香愈傷組織，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的繼代。參照姚鳳琴的方法，迷迭香愈傷組織分別在含 1.0 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L KT+5.0 mg/L AgNO3的MS固體培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)[2]。

1.2.2 不同6-BA與NAA濃度配比處理。采用2因素3水平完全隨機(jī)試驗(yàn)，在含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中添加不同濃度配比的6-BA和NAA（培養(yǎng)基pH 5.8，蔗糖20 g/L，瓊脂7 g/L），試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，共9個(gè)處理。每個(gè)處理接10瓶，每瓶接4團(tuán)大小長(zhǎng)勢(shì)均勻的愈傷組織，3次重復(fù)。培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖系數(shù)，并采用Leica數(shù)碼顯微系統(tǒng)進(jìn)行顯微觀察、拍照。

表1 迷迭香愈傷組織完全隨機(jī)試驗(yàn)不同激素水平處理

1.2.3 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光質(zhì)LED白光，光照時(shí)間為12 h/d。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

愈傷組織增殖系數(shù)=接種后愈傷組織鮮重（g）/接種前愈傷組織鮮重（g）

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)外觀形態(tài)和增殖的影響

培養(yǎng)20 d后，9個(gè)處理的迷迭香愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1所示。其中處理1為空白對(duì)照，愈傷組織質(zhì)地松散，呈白色不透明塊狀；與處理1相比，處理2、3的愈傷組織外觀為淡黃色，呈松散透明塊狀，生長(zhǎng)狀態(tài)較好，生長(zhǎng)量較大；處理7、8、9愈傷組織外觀稍有褐化，質(zhì)地緊實(shí)塊狀，生長(zhǎng)狀態(tài)較差；處理4、5、 6愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)最差，呈水潤(rùn)緊實(shí)塊狀，生長(zhǎng)量也較低。

不同處理下迷迭香愈傷組織的增殖情況及各處理間兩兩比較的結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，處理2為含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.5 mg/L NAA，該處理下迷迭香愈傷組織增殖系數(shù)最大，為10.98，和其他各處理均有顯著性差異，與除處理1（對(duì)照）以外的其他處理均有極顯著差異；處理6與處理7無顯著性差異；處理4、7有顯著性差異；處理6和處理9有顯著性差異。綜上所述，最適合迷迭香愈傷組織生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組合為MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA。

從表2可看出，各因素對(duì)迷迭香愈傷組織增殖的影響均達(dá)到顯著性水平，從3者的F值大小可以看出，影響迷迭香愈傷組織增殖的主次因素為：6-BA>NAA>6-BA×NAA。

2.2 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

不同植物激素處理下的愈傷組織細(xì)胞形態(tài)如圖3所示。其中，處理2、5、6、7、8的細(xì)胞形態(tài)大小與處理1基本相似，圖片省略。從圖3可看出，在LED白光下培養(yǎng)20 d后，處理1（對(duì)照）的愈傷組織細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異，小部分細(xì)胞分裂旺盛，大部分細(xì)胞分化畸形；處理3的細(xì)胞均一性較好，細(xì)胞分化較少；處理4的細(xì)胞大小相對(duì)其他處理的較小，并且細(xì)胞分化較多；處理9有部分細(xì)胞相對(duì)較大。

3 結(jié)論與討論

3.1 6-BA不利于迷迭香愈傷組織的增殖

試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)添加0.5 mg/L NAA最適于迷迭香愈傷組織增殖，6-BA可導(dǎo)致迷迭香愈傷組織褐化。單獨(dú)加6-BA時(shí)，濃度越高，愈傷組織水潤(rùn)褐化越嚴(yán)重，進(jìn)而抑制迷迭香愈傷組織增殖生長(zhǎng)。6-BA與NAA二者對(duì)愈傷組織的增殖影響是相互的，當(dāng)6-BA與NAA濃度比為1∶1時(shí)，愈傷組織的增殖系數(shù)最差，水潤(rùn)褐化嚴(yán)重。說明6-BA與NAA的相互作用對(duì)迷迭香愈傷組織的褐化情況有顯著性影響。潭文澄等[9]研究表明，6-BA能刺激多酚氧化酶的活性，促進(jìn)酚類物質(zhì)合成，加速愈傷組織褐化，NAA可延緩多酚合成，減輕褐化。

在該試驗(yàn)中，與空白對(duì)照相比，在含有1.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.5 mg/L NAA

時(shí)愈傷組織增殖系數(shù)最大，為10.98；單獨(dú)添加1.0 mg/L NAA時(shí)愈傷組織增殖系數(shù)減小，為6.48，說明適宜濃度NAA能有效促進(jìn)愈傷組織增殖生長(zhǎng)，濃度過高或過低均不利于愈傷組織增殖。有研究表明，6-BA與NAA的濃度配比影響植物組織的形態(tài)發(fā)生及細(xì)胞分化[7]；NAA能影響多酚氧化酶的活性，抑制多酚的合成，促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，即說明6-BA促進(jìn)多酚的合成，NAA抑制多酚的合成[8]。

圖1 不同植物激素處理下迷迭香愈傷組織的外觀形態(tài)

圖2 不同植物激素處理下迷迭香愈傷組織增殖系數(shù)

表2 不同植物激素處理迷迭香愈傷組織主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

3.2 6-BA與NAA配比影響迷迭香愈傷組織細(xì)胞形態(tài)

6-BA與NAA的濃度配比影響植物組織的形態(tài)發(fā)生及細(xì)胞分化[7]，細(xì)胞分裂素只有在生長(zhǎng)素存在的前提下才能促進(jìn)細(xì)胞分裂。該試驗(yàn)顯微觀察結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素濃度配比為1∶1時(shí)，愈傷組織細(xì)胞普遍較小，細(xì)胞形態(tài)畸形多，生長(zhǎng)不均，同時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)水潤(rùn)褐化較嚴(yán)重，增殖系數(shù)最??；當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素濃度配比為2∶1時(shí)，愈傷組織細(xì)胞普遍較大，畸變形態(tài)細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞均一

性較差，增殖系數(shù)也較??；單獨(dú)添加生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素時(shí)，愈傷組織細(xì)胞形態(tài)也是大小不均，但畸形細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，其中，單獨(dú)添加1.0 mg/L NAA時(shí)愈傷組織細(xì)胞均一性最好，畸變形態(tài)細(xì)胞數(shù)量最少，單獨(dú)添加0.5 mg/L NAA時(shí)愈傷組織細(xì)胞形態(tài)也較均勻?？梢?，引起愈傷組織增殖系數(shù)與細(xì)胞形態(tài)變化的最佳激素濃度配比略有差異，造成該現(xiàn)象的原因可能是由于NAA能加速細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，1個(gè)周期內(nèi)愈傷組織生長(zhǎng)過快導(dǎo)致細(xì)胞大小分化不均勻。

圖3 不同植物激素處理下迷迭香愈傷組織的細(xì)胞形態(tài)

[1]劉明家.迷迭香組織培養(yǎng)及體內(nèi)迷迭香酸和鼠尾草酸含量測(cè)定[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2012.

[2]姚鳳琴.羅勒等4種唇形科香花植物離體培養(yǎng)與離體保存研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[3]于巧芝，劉芳，殷帆，等.不同光質(zhì)對(duì)迷迭香愈傷組織生長(zhǎng)的影響[J].園藝與種苗，2013（3）：36-39.

[4]鞠倩.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及蔗糖濃度對(duì)彩葉草組織培養(yǎng)物迷迭香酸含量的影響[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[5]白玉，高月，趙倩，等.紫茉莉愈傷組織誘導(dǎo)的激素優(yōu)化研究[J].園藝與種苗，2012（7）：52-54.

[6]呂曉玲，孫晶磊，王芳，等.外源激素對(duì)紫蘇愈傷組織誘導(dǎo)及迷迭香酸積累的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012（6）：575-579.

[7]王慧英.影響植物愈傷組織形成的因素研究[J].聊城大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010（2）：51-53.

[8]方強(qiáng)，喬勇進(jìn)，王海宏.不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源對(duì)黃芩細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2008（1）：33-37.

[9]潭文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2001.

（責(zé)任編輯 金蘋）

Effects of the Different Concentration Combinations of 6-BA and NAA on the Callus Growth in Rosmarinus officinalis L.

XU Xiao-pinget al.(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University, Fujian,Fuzhou 350002)

In this experiment,the callus of Rosmarinus officinalis was L.used as the material,and the two factors of three levels completely randomized trial was applied to study the effects of different concentration combinations of 6-BA and NAA on the callus growth on the basal MS solid medium containing 1.0 mg/L 2,4-D. The results showed that the best combination for the callus proliferation was 0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,and the proliferation coefficient was 10.98 after a day subculture cycle of 20 days.

Rosmarinus officinalis L.;Callus;BA;NAA;Proliferation

S573

A

2095-0896（2015）05-046-04

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（111ZC1401）；福建農(nóng)林大學(xué)高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目（閩農(nóng)林大規(guī)劃【2014】12號(hào)）。

徐小萍（1993-），女，福建浦城人，本科生，專業(yè)：園藝。*通訊作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源研究，E-mail：Laizx01@163.com。

2015-04-28