呂金海，呂泳慶，李純

（懷化學(xué)院1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.風(fēng)景園林學(xué)院，湖南懷化418008）

不同方法測(cè)定黃花梨的花粉活力差異性研究

呂金海1，2，呂泳慶2，李純2

（懷化學(xué)院1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.風(fēng)景園林學(xué)院，湖南懷化418008）

以黃花梨花粉為試驗(yàn)材料，研究了藍(lán)墨水染色法、I2－KI染色法、無機(jī)酸法、FCR法、液體震蕩培養(yǎng)法和瓊膠法測(cè)花粉活力的差異性.結(jié)果表明，用上述六種方法測(cè)得的黃花梨花粉活力分別為81.53%、87.1%、83.9%、80.26%、72.25%和59.8%，其中I2－KI染色法測(cè)得的花粉活力最高為87.1%，瓊膠法測(cè)得的花粉活力最低為59.8%，最高和最低值相差27.3%.并且對(duì)上述6種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析.

黃花梨花粉；生活力；測(cè)定；差異

花粉離開花粉囊以后具有生長(zhǎng)萌發(fā)活力.在果樹栽培中，進(jìn)行人工授粉，需要早期采集和貯存花粉.保存花粉的活力可以解決親本花期不遇或遠(yuǎn)距離雜交的困難.在使用采集、貯存的花粉和人工授粉之前，都要做花粉活力的鑒定［1］.

大多數(shù)梨品種自花授粉不結(jié)實(shí)，人工授粉能夠提高產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，花粉萌發(fā)能力的強(qiáng)弱對(duì)于梨的產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的意義［2］.近年來人們比較關(guān)注座果率，但對(duì)花粉萌發(fā)率大小的研究較少.本試驗(yàn)以黃花梨（Pyrus pyrifolia var.huanghua）花粉為試驗(yàn)材料，分別用不同的方法檢測(cè)花粉的活力以及萌發(fā)率，以期為梨樹田間授粉提供指導(dǎo).

1 材料采集與保存

實(shí)驗(yàn)材料取自懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院果園和金秋梨示范基地.在黃花梨花期采下含苞待放的花蕾，分別收取花粉.花粉收取保存按王羽、曾明等方法進(jìn)行［3］.

2 實(shí)驗(yàn)方法

藍(lán)墨水染色法參照姜雪婷、杜玉虎等的方法進(jìn)行［4］，取少量黃花梨花粉于載玻片上，再滴入1～2滴藍(lán)墨水，攪拌均勻后，蓋上玻片，觀察3～4個(gè)視野，每視野≥20?；ǚ郏?次重復(fù).

I2－KI染色法參照趙永平、張肖凌等的方法進(jìn)行［5］，取少量黃花梨花粉置于載玻片上，滴上1～2滴I2－KI液，放置5min后觀察.重復(fù)2～3個(gè)制片，每片取3～4個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)結(jié)果.

無機(jī)酸測(cè)定法和FCR測(cè)定法參照胡適宜方法進(jìn)行［6］，液取2～3滴工作液置于樣品上，蓋上玻片，2分鐘后觀察.觀察2～3個(gè)制片，每片取3～4個(gè)視野，統(tǒng)計(jì).

體震蕩離體萌芽培養(yǎng)法參照王欽麗、盧龍斗等的方法進(jìn)行［7］，在培養(yǎng)基上均勻散入黃花梨花粉，然后充分搖勻，24－26℃條件下恒溫培養(yǎng)30 min，觀察計(jì)數(shù).

瓊膠或明膠離體萌芽法參照李大志、謝深喜等方法進(jìn)行［8］，將黃花梨花粉均勻地點(diǎn)播在上面，25℃暗培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計(jì)花粉管生長(zhǎng)情況和萌發(fā)率.每個(gè)載玻片觀察3～4個(gè)視野，每視野≥20?；ǚ?

3 結(jié)果與分析

3.1 藍(lán)墨水染色法檢測(cè)活力

沒有染色的花粉活細(xì)胞膜具有選擇吸收的能力，被染色的花粉則沒有活力，所以呈藍(lán)色.如表1所示，黃花梨花粉在4℃避光保存了22 d后，花粉具活力百分率為81.53%.

表1 藍(lán)墨水法測(cè)定黃花梨花粉活力

3.2 I2－KI染色法檢測(cè)活力

如表2所示，黃花梨花粉在4℃避光保存了22 d后，花粉具活力百分率為87.1%.淀粉遇碘變藍(lán)色，花粉粒中淀粉的含量直接影響花粉藍(lán)色的深淺，以此作為花粉活性高低的判斷依據(jù).呈藍(lán)黑色花粉具較強(qiáng)活力，較弱的為淡藍(lán)色，無活力的花粉幾乎無色.

表2 I2－KI染色法測(cè)定黃花梨花粉活力

3.3 無機(jī)酸測(cè)定法檢測(cè)活力

如表3所示，黃花梨花粉在4℃避光保存了22 d后，花粉具活力百分率為83.9%.活的細(xì)胞在酸刺激下，質(zhì)膜變得脆弱，透過性也增大，花粉就會(huì)地吸收H＋，花粉細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)降低，吸水膨脹，活性花粉的胞質(zhì)內(nèi)含物就會(huì)噴射而出，形成“瞬時(shí)花粉管”.沒有活性的花粉因失去活性而不會(huì)形成“瞬時(shí)花粉管”.

無機(jī)酸測(cè)定法測(cè)定黃花梨花粉活力表3

3.4 FCR測(cè)定方法檢測(cè)活力

如表4所示，黃花梨花粉在4℃避光保存了22 d后，花粉具活力百分率為80.26%.熒光染料與細(xì)胞內(nèi)酯酶作用產(chǎn)生熒光素，熒光染料能自由地透過完整的原生質(zhì)膜，而熒光素不能自由地出人原生質(zhì)膜，而只在細(xì)胞內(nèi)積累，因此在熒光顯微鏡下面觀察時(shí)，有活性的花粉會(huì)發(fā)出熒光.

表4 FCR 測(cè)定法測(cè)定黃花梨花粉活力

3.5 離體萌芽液體震蕩培養(yǎng)法

如表5所示，黃花梨花粉在4℃避光保存了22 d后，用離體萌芽液體震蕩培養(yǎng)法花粉具活力百分率為72.25%.

表5 液體震蕩培養(yǎng)法測(cè)定黃花梨花粉活力

3.6 離體萌芽瓊膠或明膠法

如表6所示，黃花梨花粉在4℃避光保存了22 d后，離體萌芽瓊膠或明膠法花粉具活力百分率為59.8%.

表6 瓊膠法測(cè)定黃花梨花粉活力

4 討論

4.1 不同花粉活力測(cè)定方法測(cè)得花粉活力

本研究結(jié)果表明，用藍(lán)墨水染色法、I2－KI染色法、無機(jī)酸法、FCR法、液體震蕩培養(yǎng)法和瓊膠法測(cè)得的黃花梨花粉活力分別為81.53%、87.1%、83.9%、80.26%、72.25%和59.8%，其中I2－KI染色法測(cè)得的花粉活力最高為87.1%，瓊膠法測(cè)得的花粉活力最低為59.8%，最高值和最低值相差27.3%.

4.2 幾種測(cè)定方法的分析比較

藍(lán)墨水染色法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)單、方便，適于野外檢測(cè)，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)花粉都逐漸變藍(lán)，測(cè)得結(jié)果有可能偏高；I2－KI染色法適合測(cè)多種植物花粉，優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)單、方便，溶液易于配置，I2－KI染色法不足處是失活花粉淀粉依然存在，無論如何都會(huì)染色，測(cè)定值可能偏高.無機(jī)酸測(cè)定法使活的細(xì)胞在酸刺激下，質(zhì)膜變得脆弱，透過性也增大，花粉就會(huì)地吸收H＋，花粉細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)降低，吸水膨脹，活性花粉的胞質(zhì)內(nèi)含物就會(huì)噴射而出，形成“瞬時(shí)花粉管”，“瞬時(shí)花粉管”類似花粉管的結(jié)構(gòu)，并不是花粉管，檢測(cè)結(jié)果容易偏高［9］.FCR測(cè)定花粉活力的方法觀察的熒光需經(jīng)過熒光15 min后就會(huì)褪色，雖然可以同時(shí)測(cè)定酶活與質(zhì)膜兩個(gè)指標(biāo)，但是需要熒光顯微鏡且需要重復(fù)測(cè)定，穩(wěn)定性差，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)［10］.離體萌芽和瓊膠測(cè)定法需要配培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)條件不同測(cè)定結(jié)果有較大差距，但在相同條件下測(cè)定，測(cè)定結(jié)果有一定可比性.

伏秦超、王娟等以肉果秤錘樹花粉為材料，用TTC法、I2－KI法、過氧化物酶沉淀法和醋酸洋紅法4種方法測(cè)定的花粉活力分別為78.45%、0%、100%和37.01%，差異較大［11］.徐斌、彭莉霞等研究表明，用MTT法、TTC法和離體萌發(fā)法測(cè)定杜鵑紅山茶花粉活力結(jié)果也不一樣，最高和最低相差34.4%［12］.劉偉等用I－KI法、氯化三苯基四氮唑（TTC）法、離體萌發(fā)法連續(xù)7d對(duì)淡黃花百合的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果是花粉活力不完全相同，但相差不大［13］.由此推測(cè)，不同植物花粉活力的測(cè)定應(yīng)該篩選出各自最適合的方法.

［1］左丹丹，明軍，劉春，等.植物花粉生活力檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（16）：4742－4745.

［2］張振銘，胡化廣，顧全局，等.不同品種梨花粉萌發(fā)的研究［J］.煙臺(tái)果樹，2009（1）：20－22.

［3］王羽，曾明，毛寶琴，等.幾個(gè)南方早熟梨品種授粉試驗(yàn)［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，27（6）：830－833.

［4］姜雪婷，杜玉虎.梨43個(gè)品種花粉生活力及4種測(cè)定方法的比較［J］.果樹學(xué)報(bào)，2006，23（2）：178－181.

［5］趙永平，張肖凌，魏玉杰，等.不同方法檢測(cè)金盞花花粉生活力比較研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（22）：13－14.

［6］胡適宜.花粉生活力的測(cè)定［J］.植物學(xué)通報(bào)，1993，10（2）：60－62.

［7］王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測(cè)定［J］.植物學(xué)通報(bào)，2002，19（3）：365－373.

［8］李大志，謝深喜，魏岳榮，等.湖南主要梨品種花粉生活力研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)黨報(bào)，1996（3）：184－187.

［9］王化幫.李不同品種花粉生活力的測(cè)定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（9）：1639－1656.

［10］李靖，王政.花粉生活力的測(cè)定［J］.中國果樹，2006，7（4）：22－32.

［11］伏秦超，王娟，張西玉，等.肉果秤錘樹花粉活力測(cè)定方法［J］.分子植物育種，2015，13（5）：1146－1150.

［12］徐斌，彭莉霞.杜鵑紅山茶花粉活力測(cè)定方法的比較研究［J］.北方園藝，2015（13）：88－90.

［13］劉偉，丁長(zhǎng)春，沐建華.淡黃花百合花粉活力及其測(cè)定方法比較［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：198－199.

Study on Determ ining the Differences of the Pollen Viability of Huanghua Pear w ith Different M ethods

LV Jin-hai1，2，LV Yong-qing2，LIChun2
（1.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources；2.College of Landscape Architecture，Huaihua University，Huaihua，Hunan 418008）

With the Huanghua pear pollen as experimental materials，the thesis studied the differences in determining the viability by using the blue inkstaining，I2－kI staining，inorganic acid method，F(xiàn)CR method，Liquid concussion cultivating method and agar－agar method.The results showed that the pollen activity rates of Huanghua pear were 81.53%，87.1%，72.25%，80.26%and 59.8%.The pollen activity rates determined by using different methods were not the same.The variability of maximum pollen activity rate and minimum pollen activity rate was 27.3%，the maximum pollen activity rate determined by using I2－kIstainingmethod 87.1%，and theminimum pollen activity rate determined by using agar－agarmethod 59.8%.The advantages and disadvantages of the sixmethods had been compared and analyzed too.

Huanghua pear pollen；viability；determine；difference

Q945

A

1671－9743（2015）11－0054－04

2015－07－23

呂金海，1968年生，男，湖南永順人，教授，研究方向：資源植物開發(fā)與利用.