孫青青，周愛萍

骨關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié)軟骨損傷后，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬和功能障礙并可逐漸發(fā)生退行性變。部分患者因害怕疼痛未能進(jìn)行早期的康復(fù)訓(xùn)練，致局部肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)囊等軟組織與關(guān)節(jié)廣泛粘連，使得關(guān)節(jié)屈伸、旋轉(zhuǎn)功能受阻，限制了正常的關(guān)節(jié)運(yùn)動，影響關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)［1-2］。本研究以新西蘭大白兔為研究對象建立膝關(guān)節(jié)全層缺損模型，觀察6周持續(xù)被動運(yùn)動(continuous passive motion，CPM)對膝關(guān)節(jié)損傷后周圍組織(側(cè)副韌帶)內(nèi)彈性蛋白的影響，為臨床常規(guī)使用CPM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與分組 實(shí)驗(yàn)的新西蘭雄性大白兔15只由青島康大公司提供，兔齡為70 d，體重為1.165～2.335 kg，麻醉采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)，在兔兩后退膝關(guān)節(jié)髕骨內(nèi)側(cè)作2 cm的弧形切口，逐層切開，暴露股骨髕骨面，在其中心處用電鉆致其關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，深度以缺損區(qū)有滲血為準(zhǔn)。見圖1。用生理鹽水沖凈軟骨碎片及凝血塊，逐層關(guān)閉切口，滅菌紗布覆蓋包扎。術(shù)后隨機(jī)分成3組即制動組、自由活動組、CPM組，每組5只含10個(gè)膝關(guān)節(jié)。制動組采用自制襪套屈膝固定，見圖2。

圖1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損造模

圖2 襪套制動免后腿造模

1.2 術(shù)后處理 術(shù)后所有兔子連續(xù)注射3 d青霉素(40萬U/次，2次/d)。制動組采用襪套，屈膝位制動6周;自由活動組籠內(nèi)活動6周;CPM組籠內(nèi)自由活動并每天上下午各1 h CPM儀運(yùn)動6周，運(yùn)動的起始角度為 20°，速度為 8°/s［3］，在其耐受范圍內(nèi)逐漸增加角度，最大角度為100°。

1.3 蛋白免疫印跡(western blotting)彈性蛋白的檢測 6周后采用靜脈注射空氣處死所有兔子取其膝關(guān)節(jié)側(cè)副韌帶，所有標(biāo)本保存在－80℃。蛋白提取:取出標(biāo)本先將其剪碎，迅速充分研磨后加入細(xì)胞裂解液，1300 r離心4 min，離心機(jī)半徑為95 mm。取上清液，保存在－20℃，采用NanoDrop分光光度計(jì)測量各組標(biāo)本蛋白的濃度，光波長度設(shè)定為280 nm。采用western blotting檢測彈性蛋白的表達(dá):聚丙烯酰胺凝膠電泳采用5%濃縮膠、10%分離膠，上樣量20 μg，電壓80 V，電泳結(jié)束后取出凝膠。半干法轉(zhuǎn)印:恒流2 mA/cm2下轉(zhuǎn)膜70 min，確保轉(zhuǎn)膜成功;轉(zhuǎn)移至5%的封閉液中，室溫下平緩搖動2 h，加入彈性蛋白一抗，放入冰箱4℃過夜;TBST緩沖液漂洗硝酸纖維素薄膜3次，每次10 min;加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，TBST漂洗硝酸纖維素薄膜3次，每次10 min。DAB顯色:將硝酸纖維素薄膜置于暗盒中均勻的滴上DAB顯色劑，反應(yīng)10 min;將硝酸纖維素薄膜放入掃描儀中成像，βactin為內(nèi)參，進(jìn)行灰度值的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，各組彈性蛋白比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重比較 三組兔子術(shù)前體重為(2.014±0.194)kg，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后CPM組兔子能安靜耐受2 h的訓(xùn)練，訓(xùn)練期間飲食正常;自由活動組一切如常;制動組兔子膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)僵硬、伸屈活動受限，食欲明顯下降，6周后平均體重較術(shù)前減少，但與術(shù)前比較差異仍沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組兔術(shù)前、術(shù)后6周體重的比較(kg，±s)

表1 各組兔術(shù)前、術(shù)后6周體重的比較(kg，±s)

組別 n 術(shù)前 術(shù)后6周5 2.17 ±0.25 2.06 ±0.32自由活動組 5 2.00 ±0.18 2.97 ±0.18 CPM組制動組5 2.01 ±0.25 2.54 ±0.16

2.2 彈性蛋白表達(dá)的比較 western blotting所得電泳條帶的顏色越深表明其蛋白的表達(dá)越高，三組中彈性蛋白電泳條帶的灰度值分別與其相對應(yīng)的βactin電泳條帶的灰度值相比，三組的彈性蛋白平均表達(dá)量分別是制動組(0.84±0.25)，自由活動組(2.91 ±0.34)，CPM 組(2.04 ±0.69)。制動組彈性蛋白的表達(dá)均低于自由活動組和CPM組(P＜0.01)，而CPM組彈性蛋白的表達(dá)低于自由活動組(P ＜0.01)。見圖3。

圖3 彈性蛋白的表達(dá)

3 討論

3.1 彈性蛋白的功能 彈性蛋白通常分布在結(jié)締組織、血管、肺泡壁等組織中，是一種無定形彈性體，賦予組織彈性、伸縮性等功能［4］。膝關(guān)節(jié)軟骨損傷往往不能自發(fā)修復(fù)，并且軟骨破壞不會局限、停止，其逐漸發(fā)展、擴(kuò)大，嚴(yán)重者發(fā)展成為骨性關(guān)節(jié)炎，引起關(guān)節(jié)長期疼痛、關(guān)節(jié)韌帶的攣縮和關(guān)節(jié)功能障礙，如果較長時(shí)間不運(yùn)動，會導(dǎo)致血運(yùn)不暢，滲出的漿液纖維蛋白留在關(guān)節(jié)囊產(chǎn)生沉積易形成纖維組織致粘連，最終形成瘢痕導(dǎo)致韌帶攣縮、關(guān)節(jié)僵硬等［5-7］。當(dāng)膝關(guān)節(jié)的功能發(fā)生改變時(shí)，作為內(nèi)部結(jié)構(gòu)功能基礎(chǔ)之一的彈性蛋白是如何隨之改變，正是本研究想要探討的。

3.2 CPM的特點(diǎn)與運(yùn)用 Salter等［8］于20世紀(jì)70年代提出滑膜關(guān)節(jié)持續(xù)被動運(yùn)動理論，并將其應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損后的修復(fù)過程，發(fā)現(xiàn)可起到加速關(guān)節(jié)周圍的韌帶和肌腱的愈合與再生的滿意療效。CPM作為軟骨損傷的一種輔助治療方法，具有藥物和手術(shù)不能替代的獨(dú)有優(yōu)勢，逐漸受到國內(nèi)外相關(guān)專業(yè)與機(jī)構(gòu)的重視和應(yīng)用，其所給予的大范圍被動周期性正弦曲線性緩慢運(yùn)動，使肌肉凝膠成分如水和蛋白多聚糖黏稠度減低，肌肉的被動僵硬程度減少，致使彈性增加、攣縮及痙攣得到有效緩解，故被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)粘連、僵硬、肌肉攣縮、骨質(zhì)疏松等方面［9-12］，但從分子水平來證實(shí)CPM療效的報(bào)道目前較少見。

3.3 彈性蛋白的檢測與CPM臨床意義 本研究中制動組所有膝關(guān)節(jié)在術(shù)后6周均有瘢痕組織形成，而出現(xiàn)了僵硬等功能障礙，是較長時(shí)間缺乏鍛煉，血運(yùn)循環(huán)差造成，與學(xué)者郭祁等［13］的研究一致。6周后所有實(shí)驗(yàn)兔的體重與術(shù)前相比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但制動組的平均體重明顯降低，這與術(shù)后制動舒適度降低，傷口的疼痛等影響了食欲進(jìn)而導(dǎo)致體重的下降有關(guān);消瘦也會消耗體內(nèi)蛋白影響術(shù)后的恢復(fù)，由此出現(xiàn)局部影響帶動全身的平均體重下降，由此我們在實(shí)驗(yàn)中關(guān)注了體重的變化。Salter等［8］的實(shí)驗(yàn)證明，對于制動所引起的并發(fā)癥作CPM能夠起到很好的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)6周后各組間彈性蛋白表達(dá)的差異說明:CPM和自由活動可以防止因制動產(chǎn)生的關(guān)節(jié)僵硬、韌帶攣縮等，自由活動組的數(shù)據(jù)提示效果更好，這可能與兔子本身運(yùn)動的強(qiáng)度比CPM大有關(guān)。也有研究顯示患者術(shù)后恢復(fù)過程中進(jìn)行CPM，能夠有效提高鍛煉的效果，保證患者鍛煉天數(shù)的持續(xù)性和有效性，有利于促進(jìn)患者膝關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)和提高，且恢復(fù)的效果明顯比自主鍛煉好［14］。Chang等［15］在CPM治療和非細(xì)胞聚丙交酯-乙交酯共聚物植入兔軟骨再生的聯(lián)合效應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，CPM能有效防止關(guān)節(jié)周圍組織痙攣的形成。本研究中除制動組外其他組無一例有痙攣現(xiàn)象發(fā)生，提示術(shù)后早期的康復(fù)訓(xùn)練可以增加韌帶強(qiáng)度功能鍛煉，對減少關(guān)節(jié)粘連，防止關(guān)節(jié)僵硬，肌肉萎縮等并發(fā)癥有加速康復(fù)作用。

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