牛志強(qiáng)，劉國順，師婷婷，張松濤，賈宏昉，張洪映，崔紅，楊永霞

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，煙草行業(yè)栽培重點實驗室，鄭州市文化路95號 450002

生物技術(shù)

煙草NCED3基因的克隆及其干旱脅迫表達(dá)分析

牛志強(qiáng)，劉國順，師婷婷，張松濤，賈宏昉，張洪映，崔紅，楊永霞

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，煙草行業(yè)栽培重點實驗室，鄭州市文化路95號 450002

為揭示9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶( 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)在煙草生長發(fā)育過程中的功能，通過同源克隆方法獲得煙草品種K326類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因NCED3兩個cDNA全長序列。序列分析表明：K326 NCED3-1和NCED3-2基因分別包含一個1842bp和1830bp的開放讀碼框(ORF),各編碼613個和609個氨基酸。預(yù)測蛋白質(zhì)分子量分別為68177.8 Da和67754.2Da，理論等電點(pI)各為7.66和7.28?？缒^(qū)預(yù)測、親水性和信號肽分析表明很可能是定位于線粒體膜上的親水性跨膜蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型顯示此蛋白結(jié)構(gòu)以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明NCED3-1與NCED3-2空間結(jié)構(gòu)極為相似。PEG6000脅迫分析表明，干旱脅迫可以誘導(dǎo)NCED3基因表達(dá)以及內(nèi)源ABA的積累。且在處理12h之前，NCED3表達(dá)與ABA累積速度均呈現(xiàn)升高趨勢，之后逐漸降低。研究結(jié)果為解析NCED3在煙草抗旱方面的功能提供一定的研究基礎(chǔ)。

煙草；NCED3基因；克?。恍蛄蟹治?；表達(dá)；ABA

煙草類胡蘿卜素是煙葉重要致香物質(zhì)的前體物[1-3]，其降解和熱裂解可產(chǎn)生近百種香氣化合物[4-5]，同時還是一種防御化合物[6-7]。植物生長發(fā)育過程中，類胡蘿卜素的含量不僅受到其合成調(diào)控的影響[8]，還會受到一些生物和非生物途徑分解的影響[9]。近年來，一個能裂解類胡蘿卜素產(chǎn)生脫輔基類胡蘿卜素被稱為類胡蘿卜素雙加氧裂解酶(carotenoid cleavage dioxygenases、CCDs)的基因家族[10]已被鑒定。CCDs普遍存在于哺乳動物、植物和細(xì)菌中[11]。在模式植物擬南芥中，CCDs家族有9個成員(CCD1，4，7，8 和 NCED2，3，5，6，9)[12-14]，其中 NCED2，3，5，6，9參與植物激素ABA的合成，NCED催化裂解9-順式新黃質(zhì)和9-順式紫黃質(zhì)，生成C15黃質(zhì)醛和一個C25的副產(chǎn)物，黃質(zhì)醛作為C15骨架經(jīng)一系列變化形成ABA[15-16]，ABA作為逆境信號在植物抗逆特別是抗旱中起著重要的作用[17-18]。相對于CCDs基因家族的其它成員而言，ABA合成關(guān)鍵酶基因NCED3的啟動一直被認(rèn)為是操縱ABA信號產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制[19]。目前，NCED3在大豆[20]、豇豆[21]、鱷梨[22]、擬南芥[23]和蘋果[24]等植物中已有詳細(xì)研究，在煙草中鮮有報道。鑒于此，本研究克隆了煙草K326 NCED3基因的全長cDNA序列，采用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行分析，檢測了PEG6000干旱脅迫處理對NCED3基因表達(dá)和ABA含量的影響，為進(jìn)一步研究煙草NCED3基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為普通煙草品種K326。采用漂浮育苗，溫室培養(yǎng)至5-6片真葉幼苗，移至含珍珠沙的花盆中培養(yǎng)。在光暗交替周期為12 h/12 h、溫度為24℃-26℃、相對濕度為60%的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，用1/2濃度的Hoagland培養(yǎng)液澆灌，兩天一次。待幼苗長至7，8片葉(約6周)時，用于干旱處理。采用20%（200g/L）的PEG6000溶液對煙草幼苗進(jìn)行滲透脅迫，以不加PEG6000的幼苗作為對照。每個處理3組重復(fù)，每組兩株，在處理0、1、4、8、12、24、36、48、72h時取第三片葉，稱其鮮重后置液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α為本試驗室保存。載體pMD19-T、普通Taq酶、高保真Pfu酶、MarkerDL2000等試劑購自TaKaRa；DNA凝膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒純化回收試劑盒購于Omega公司，改良的Hoagland’s (霍格蘭氏)營養(yǎng)液，PEG6000（聚乙二醇）購自天津市福晨化學(xué)試劑廠，Real Time PCR 采用SYBR Green Master mix試劑盒(Vazyme)，購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 NCED3全長基因的克隆

采用Trizol法提取RNA，并通過隨機(jī)引物法將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參考GenBank收錄的煙草NCED3基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物NCED3F (5’-ATCAAAAATAGGTAACTATGGCA TC-3’)和 NCED3R（5’-CCACAACTTCAACTCTT AATTTCAC-3’）擴(kuò)增煙草NCED3基因序列，PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72 ℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠分離?；厥占兓筮B接到 pMD19-T 載體,送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 序列分析

利用NCBI網(wǎng)站的軟件BLAST和ORFfinder進(jìn)行核苷酸序列比較和開放閱讀框分析。運用DNAstar軟件推測該基因編碼的氨基酸序列，Expasy Protparam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點和氨基酸組成。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域用Conserved Domains和SMART軟件進(jìn)行預(yù)測。采用ProtScale、和TMpred軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析和跨膜區(qū)預(yù)測。用SignalP 4.1 Server和TargetP 1.1 Server分別進(jìn)行蛋白的信號肽與導(dǎo)肽分析。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)使用在線工具SOPMA進(jìn)行預(yù)測。三級結(jié)構(gòu)采用在線軟件Swiss-model進(jìn)行模擬。在NCBI數(shù)據(jù)庫下載與煙草K326 NCED3基因同源的氨基酸序列，采用ClustalW進(jìn)行序列的多重比對分析，然后利用PHYLIP程序進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.3 NCED3的表達(dá)分析

采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物(見表1)，以煙草組成型表達(dá)的核糖體蛋白基因L25為內(nèi)參。采用半定量RT-PCR和Real Time PCR進(jìn)行表達(dá)差異研究。參照Invitrogen公司的RealMasterMix (SYBR Green)試劑盒說明書進(jìn)行實時定量RT-PCR，每個樣品3次重復(fù)。Real Time PCR 數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt算法[25]進(jìn)行分析，假設(shè)目的基因在PEG6000脅迫處理下的表達(dá)量是對照（不添加PEG6000)的N倍，N = 2-ΔΔCt，ΔΔCt =Treat(Ct樣品 - Ct L25 ) - CK(Ct樣品 - Ct L25)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 ABA含量測定

取樣方法同上，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行ABA的提取和含量測定，用冰冷的80%甲醇提取，過C18柱以純化激素提取液，用于酶聯(lián)免疫測定，在酶聯(lián)免疫分光光度計上依次測定標(biāo)準(zhǔn)物濃度和樣品490nm處的OD值，根據(jù)logit曲線法計算樣品ABA濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCED3全長基因的克隆

采用 TRIzol RNA方法提取K326的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)NCED3F/NCED3R引物PCR擴(kuò)增，得到1800 bp左右的片段，回收目的片段，連接 pMD19-T 后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，運用菌落 PCR 方法鑒定陽性克隆，送生物公司測序。結(jié)果表明 K326 包含兩個NCED3 (NCED3-1與NCED3-2)，序列提交Genbank，登錄號分別為KM605434和KM605435，與NCBI收錄的K326 NCED3-1基因序列（登錄號JX101472.1）相似性分別為99%和97%。

2.2 NCED3基因和蛋白序列分析

2.2.1 NCED3基因與氨基酸序列分析

通過 ProtParam 和 ORFfinder 對所得到的K326 NCED3-1和K326 NCED3-2基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NCED3-1基因包含一個 1842bp 的完整開放讀碼框(ORF)，GC含量為40.99%。NCED3-2基因包含一個1830bp的ORF，GC含量為40.87%。NCED3-1和NCED3-2基因分別編碼613個和609個氨基酸，其中堿性氨基酸(Arg、Lys)分別為70個和69個,強(qiáng)酸性氨基酸(Asp,Glu)各69個。預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量分別為68177.8 Da和67754.2Da，理論等電點(pI)分別為 7.66和 7.28。

2.2.2 NCED3氨基酸序列同源性分析

在NCBI的GenPept數(shù)據(jù)庫中檢索與煙草K326 NCED3同源的氨基酸序列，公共數(shù)據(jù)庫中的同源序列多被命名為示9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶，預(yù)測參與對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。采用ClustalW進(jìn)行序列多重比對，利用PHYLIP進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，克隆得到的NCED3的兩個 拷貝與普通煙草NCED3-1（分別為99%和97%）親緣關(guān)系最近，其次為枸杞（分別為90%和89%）和馬鈴薯（分別為90%和89%）等茄科植物，而與葡萄（分別為74%和76%）和柑橘（均為76%）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。

圖1 NCED3系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of NCED3

2.2.3 NCED3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

使用Conserved Domains在線分析軟件對該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了比對分析和預(yù)測。由圖2-1與圖2-2可知，該基因編碼的蛋白含有NCED3蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步表明克隆到的基因為編碼NC ED3蛋白的基因。

圖2-1 NCED3-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.2-1 Protein domain analysis of NCED3-1

圖2-2 NCED3-2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.2-2 Protein domain analysis of NCED3-2

2.2.4 NCED3蛋白質(zhì)疏水性分析和跨膜區(qū)預(yù)測

蛋白質(zhì)疏水性分析、跨膜區(qū)預(yù)測分析分別采用ProtScale和TMPRED軟件進(jìn)行。圖3-1與圖3-2分別表示的是NCED3-1和NCED3-2蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果。其疏水性最大值都為2.211，最大親水峰有1處,其親水性最大值都為-2.967，最大疏水峰有1處。在氨基酸間都找到分值很高的2個跨膜螺旋區(qū)，K326 NCED3-1第一個跨膜螺旋區(qū)位于239-272位氨基酸間，方向從膜內(nèi)到膜外。第二個跨膜螺旋區(qū)位于235-251位氨基酸間，方向從膜內(nèi)到膜外。K326 NCED3-2第一個跨膜螺旋區(qū)位于235-268位氨基酸間，方向從膜內(nèi)到膜外。第二個跨膜螺旋區(qū)位于231-247位氨基酸間，方向從膜內(nèi)到膜外。

圖3-1 NCED3-1蛋白質(zhì)疏水性分析Fig.3-1 Protein hydrophobicity analysis of NCED3-1

圖3-2 NCED3-2蛋白質(zhì)疏水性分析Fig. 3-2 Protein hydrophobicity analysis of NCED3-2

2.2.5 NCED3蛋白質(zhì)信號肽與導(dǎo)肽分析

用SignalP 4.1 Server對NCED3蛋白進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果表明NCED3-1和NCED3-2蛋白沒有信號肽。用TargetP 1.1 Server對NCED3-1和NCED3-2蛋白進(jìn)行導(dǎo)肽分析，這兩種蛋白定位在線粒體上的分值分別為0.461和0.471，通過分泌途徑運輸?shù)姆种捣謩e為0.026和0.030。

2.2.6 NCED3蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用在線工具SOPMA預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，K326 NCED3-1和K326 NCED3-2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中分別含有13.61%和13.96%的α螺旋、23.44%和21.51%的延伸鏈、6.07%和5.42%的β折疊，56.89%和59.11%的無規(guī)則卷曲。β折疊和無規(guī)則卷曲是NCED3蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要成分。

2.2.7 NCED3蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

將翻譯后的氨基酸序列提交瑞士生物信息研究所Swiss-model,模擬蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。NCED3-1與NCED3-2蛋白三級結(jié)構(gòu)極其相似，以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。僅在無規(guī)則卷曲存在部分差異。

圖4 NCED3-1與NCED3-2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型Fig.4 Protein tertiary structure model of NCED3-1 and NCED3-2

2.3 PEG6000 脅迫下NCED3基因表達(dá)分析

圖5為PEG6000處理煙株后NCED3的表達(dá)結(jié)果。由圖可知，PEG6000 干旱脅迫處理可以誘導(dǎo)NCED3基因的表達(dá)，尤其是NCED3-2表達(dá)更為強(qiáng)烈?？傮w上，脅迫后NCED3-1和NCED3-2基因表達(dá)規(guī)律相同，均呈現(xiàn)隨著PEG6000干旱脅迫處理時間增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)的趨勢，且均在處理12h達(dá)到最強(qiáng)，之后緩慢減弱。本研究中脅迫處理1h的表達(dá)量要高于4h的表達(dá)量，這可能是由于煙株受脅迫刺激呈現(xiàn)強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致。

圖5 NCED3對PEG6000干旱脅迫的應(yīng)答模式Fig.5 Response pattern of NCED3 after PEG6000 drought treatment

2.4 ABA含量分析

由圖6可知，20%PEG6000處理后，煙草葉片內(nèi)源ABA含量呈現(xiàn)隨著處理時間增加，逐漸升高的趨勢。脅迫處理8h前煙草葉片內(nèi)源ABA含量增加相對緩慢。處理8-12h，煙草葉片ABA含量急劇上升，12h后增速相對變緩。至48 h時，葉片ABA含量已升至94ng/g，是未處理前的3倍。

圖6 PEG6000干旱脅迫下ABA累積曲線Fig.6 Cumulative curve of ABA after PEG6000 drought treatment

3 結(jié)論與討論

本研究中，我們克隆并獲得K326 NCED3基因兩個拷貝的全長cDNA序列，同源性分析表明，它們與普通煙草及其它茄科類植物的NCED3基因同源性極高。說明這兩個拷貝是煙草K326 NCED3基因。兩個拷貝的核苷酸序列相似性達(dá)97.12%，長度存在12個堿基的差異，其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出高度的相似性，表明這兩個拷貝功能可能類似。疏水性跨膜預(yù)測分析表明，K326 NCED3-1和NCED3-2均含有兩個跨膜螺旋區(qū)，它們具有明顯的親水和疏水區(qū)，沒有信號肽，這些特點可以推測NCED3-1和NCED3-2可能為跨膜蛋白，蛋白合成之后在細(xì)胞質(zhì)線粒體膜上行使其功能。

以往的研究表明，NCED通過調(diào)控ABA合成在植物的抗逆抗旱中起著重要作用[26]。在煙草中過表達(dá)柑橘NCED基因，可增加正常和干旱模式下ABA的含量[27]。而外源添加ABA可以提高酸橘NCED3的表達(dá)水平[28]，這說明，ABA信號的產(chǎn)生受NCED3基因的持續(xù)激活和ABA生物合成和分解代謝協(xié)同調(diào)控[29]。為此，我們采用PEG6000模擬干旱處理，研究了煙草NCED3基因表達(dá)及ABA的積累情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可誘導(dǎo)NCED3-1和NCED3-2基因表達(dá)，且在處理12h之前表達(dá)急劇增加，之后有所降低。而干旱脅迫后煙草內(nèi)源ABA的積累規(guī)律也說明12h前積累較快，之后呈緩慢增長趨勢，這說明NCED3的表達(dá)不是瞬時性的，即一旦NCED3被誘導(dǎo)表達(dá)后其表達(dá)水平也將處于相對穩(wěn)定的水平，ABA積累規(guī)律的研究結(jié)果與基因表達(dá)規(guī)律一致，這與任慧波等[29]的研究結(jié)果基本一致。前人研究發(fā)現(xiàn)，在煙草中過表達(dá)黃龍膽（GentianaLutea）和柱花草等（Stylosanthes guianensis）植物的NCED基因均可提高轉(zhuǎn)基因植物的內(nèi)源ABA水平、水分脅迫抗性、增加對強(qiáng)光和氧化脅迫的抗性進(jìn)而提高煙草的耐旱和耐鹽能力[30]。這說明NCED可以調(diào)節(jié)植物對于非生物逆境的適應(yīng)能力。

本研究對煙草NCED的克隆和表達(dá)分析有助于了解煙草響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制，為將來應(yīng)用RNAi干擾和過表達(dá)技術(shù)研究該基因功能，并通過植物基因工程提高煙草的抗旱性及抗旱育種奠定一定的研究基礎(chǔ)。

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[29]任慧波,范意娟,魏開發(fā),等.NCED3基因的持續(xù)誘導(dǎo)及ABA合成與代謝的協(xié)同調(diào)控在擬南芥ABA信號積累中的作用[J].科學(xué)通報,2007,52(1):59-66.

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Cloning ofNCED3gene inNicotiana tabacumand analysis of its drought stress-induced expression

NIU Zhiqiang,LIU Guoshun,SHI Tinging,ZHANG Songtao,JIA Hong fang,ZHANG Hongying,CUI Hong,YANG Yongxia
Key laboratory of Tobacco Cultivation,College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China

In order to reveal the function of NCED3 gene in tobacco plant growth and development,two copies (NCED3-1 and NCED3-2)of full-length cDNA sequence of tobacco nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase3 were cloned from K326 by homology cloning strategy.Sequences analysis showed that NCED3-1 and NCED3-2 contained 1842-bp and 1830-bp open reading frame (ORF ) and coded 613 and 609 amino acid residues,and the calculated molecular mass was 68177.8Da and 67754.2Da with the theoretical isoelectric point (pI) of 7.22 and 7.28,respectively.Protein hydrophobicity,transmembrane domains and signal peptide analysis indicated that the protein might be transmembrne and hydrophilic,and located on mitochondrial membrane.Secondary structure prediction results showed that they were mainly made up by beta turns and random coil.Tertiary structure prediction results displayed that NCED3-1 showed high similarity with NCED3-2.Expression patterns under abiotic stress responses suggested that PEG6000 could induce expression of NCED3 and accumulation of ABA.Expression of NCED3 and ABA accumulation rate both increased before 12h treatment,and then decreased gradually.These results provided some basis for drought function analysis of NCED3.

tobacco;NCED3;cloning;sequence analysis;expression;ABA

牛志強(qiáng)，劉國順，師婷婷,等.煙草NCED3基因的克隆及其干旱脅迫表達(dá)分析[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（3）

河南省教育廳自然科學(xué)研究項目（No.14B180034）;中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項濃香型項目（No.110201101001 TS-01)

牛志強(qiáng)(1987—)，男，在讀碩士研究生，研究方向為煙草生物技術(shù)，Email: nzq113@163.com

楊永霞(1980—)，女，博士，講師，研究方向為煙草生物技術(shù)，Tel: 0371-63558121，Email：yyx624@126.com

2014-10-12

: NIU Zhiqiang,LIU Guoshun,SHI Tinging,et al.Cloning of NCED3 gene in Nicotiana tabacum and analysis of its drought stress-induced expression [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)