陳丕庭，馬樹杰，殷培軍,3，鄭偉，馬志卿，2，張興，2

1西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌 712100；

2陜西省生物農藥工程技術研究中心，陜西楊凌 712100；

3黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島 266555

植物保護

植物源抗病毒劑VFB-1防治煙草花葉病毒病研究

陳丕庭1，馬樹杰1，殷培軍1,3，鄭偉1，馬志卿1，2，張興1，2

1西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌 712100；

2陜西省生物農藥工程技術研究中心，陜西楊凌 712100；

3黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島 266555

以植物源抗病毒劑VFB為基礎，經配方改造和工藝改進，優(yōu)化出了植物源抗病毒劑VFB-1。為探究VFB-1對煙草花葉病的防治作用，本研究采用半葉枯斑法測定了VFB-1對TMV的體外鈍化、初侵染和復制增殖抑制活性；采用盆栽法和田間小區(qū)試驗評價了VFB-1對煙草花葉病毒病的預防及治療效果。結果表明，VFB-1對煙草花葉病毒(TMV)具有明顯的體外鈍化作用，鈍化30min后，抑制率達82.77%；對TMV的初侵染和復制增殖具有較好的抑制作用，24 h的抑制率分別達到69.80%和54.07%?盆栽藥效試驗中，VFB-1100倍稀釋液的預防效果為70.23%，治療效果為35.70%；田間藥效試驗表明，VFB-1對煙草花葉病毒病有較好的預防和治療作用，其200倍稀釋液藥后21d的預防效果仍為40%以上，400倍液的預防效果明顯高于VFB，且與病毒A（20% 嗎啉胍·乙銅WP）相當；其200倍液14d的治療效果顯著高于VFB（200倍稀釋液）和病毒A（400倍稀釋液）處理。可見，植物源抗病毒劑VFB-1對TMV具有良好的預防和治療效果，開發(fā)前景良好?

VFB-1；煙草花葉病毒；抗病毒活性；煙草花葉??；植物源農藥

植物病毒病在農業(yè)生產中發(fā)生普遍、危害嚴重，且難以防治[1]。據統(tǒng)計，我國大多數煙區(qū)煙草花葉病流行年份田間發(fā)病率高達50%以上，嚴重者絕收[2-3]。由于植物病毒對寄主細胞具有絕對寄生性，病毒傳播方式具有多樣性，且植物缺乏完整的免疫系統(tǒng)，因而高效抗病毒劑的開發(fā)存在極大困難，至今尚未有理想的化學防治藥劑[4]。大量研究表明，植物源農藥具有安全、作用方式多樣、與環(huán)境相容等優(yōu)點，因此加強植物源抗病毒劑的研究成為新農藥開發(fā)及植物病毒病防治的重要工作[5-7]。目前已發(fā)現(xiàn)多種植物提取液具有良好的抗TMV活性[8-12]。

VFB是由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心研制的一種植物源抗病毒劑，前期試驗表明其對煙草、辣椒等多種作物上的多種植物病毒病均具有良好的預防作用，但治療效果一般[13-17]。李晨等已經對VFB的配方及加工工藝進一步改進，藥效有明顯提高，但成本仍然偏高，工藝較為復雜[18]。在此基礎上，經進一步的配方和工藝優(yōu)化，研制出了VFB-1，初步的室內試驗表明，該配方抗病毒活性優(yōu)于VFB，但田間效果尚不明確。基于此，本研究以TMV為供試毒源，采用半葉法、盆栽法及田間小區(qū)試驗，較為系統(tǒng)地評價VFB-1對TMV的抑制作用，以期為該藥劑的進一步應用提供依據和奠定基礎?

1 材料與方法

試驗于2012年6月至2013年10月在西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心和河南省澠池縣果園鄉(xiāng)李家村中煙種植基地完成。

1.1 材料

寄主：以心葉煙 (Nicotiana glutinosa L.)為枯斑寄主，以普通煙(Nicotiana tabacum) K326為系統(tǒng)寄主。將煙草種子與一定量基質混勻后均勻灑在裝有基質的育苗盤，澆水適量，于適宜條件下(溫度22±1℃，光照16h/d，濕度60%)培養(yǎng)，當幼苗長至4～6片真葉時供試?

供試毒源：TMV由西北農林科技大學植物保護學院病毒研究室提供，保存于普通煙(N.tabacum)上，參照Gooding等的方法進行提純[19]。TMV接種液由新鮮病葉和 PBS緩沖液 (0.01 mol·L-1，pH 7.2)按1﹕2(W/V)的比例研磨后，用4層紗布過濾待用?

供試藥劑：VFB-1和VFB水劑由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供；20%病毒A可濕性粉劑（20% 嗎啉胍·乙銅WP），由惠州市中迅化工有限公司生產。

1.2 室內生測試驗方法

室內生測均采用半葉枯斑法[20]，在22±1℃室溫下進行，以健康、生長旺盛的5～6葉期心葉煙供試。

1.2.1 體外鈍化作用

鈍化試驗中，左半葉接種供試藥劑與病毒等體積混合液，右半葉接種蒸餾水與病毒等體積混合液(對照)。VFB-1、VFB和病毒A均稀釋50倍，鈍化時間分別為0.5、1和2 h，共9個處理。每處理接種6片葉子，重復3次，3 d后統(tǒng)計枯斑數，計算抑制率。枯斑抑制率按照“1.5”中公式計算。

1.2.2 抑制TMV初侵染和增殖作用

VFB-1和VFB的供試濃度分別為50、100和200倍稀釋液，而以病毒A400倍稀釋液為對照。初侵染試驗中，各處理分別在施藥24h后接種病毒；增殖試驗中，均在接種病毒后施藥。施藥方式為涂抹法，左半葉涂抹供試藥劑，右半葉為清水對照。每處理接種6片葉子，重復3次，3 d后統(tǒng)計枯斑數，計算抑制率。枯斑抑制率按照“1.5”中公式計算。

1.3 盆栽試驗方法

選擇 5-6 葉期，長勢一致、健壯的普通煙供試。試驗設預防組（第3次施藥 24 h后接種 TMV）、治療組（接種 TMV 24 h后施藥 3 次）和對照組（只接種不施藥）。分別用 VFB-1和VFB 100 倍液及病毒A 400倍液噴霧處理，每 5 d 施藥一次，共施藥三次。TMV接種濃度為 1：20(W/V)。施藥結束后 7d 檢查發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數及防治效果。每處理 60 株煙苗，試驗重復 3 次。

1.4 田間藥效試驗方法

田間小區(qū)藥效試驗地位于河南省澠池縣果園鄉(xiāng)李家村連續(xù)3年種植煙草、病毒病常年發(fā)生嚴重的田塊進行，煙草品種為中煙100，煙田肥力較為均勻，煙苗5月3日移栽，生長健壯，長勢均勻，自然發(fā)病。試驗分為預防試驗和治療試驗。預防試驗在煙苗移栽后尚未發(fā)病時進行，設VFB-1和VFB的 100倍液、200倍液和400倍液3個劑量，常量噴霧處理，以20%的病毒A可濕性粉劑400倍液為對照，并設清水對照，共7個處理，每處理重復3次，每隔7d施藥1次， 3次施藥7d后 (7月16日)調查病情，共調查3次。治療試驗在煙苗發(fā)病初期時進行，設VFB-1和VFB的 100倍液、200倍液2個劑量處理，以20%的病毒A可濕性粉劑400倍液為對照，并設清水對照，共5個處理，每處理重復3次，施藥前調查病情指數，施藥后7天(7月16日)調查病情，每隔7d施藥1次，共2次。小區(qū)面積為20m2，采用隨機排列，處理間設立保護行。

田間調查病情分級標準為：0級，全株無病；1級，心葉明脈或輕微花葉，病株無明顯矮化；3級，1/3葉片花葉但不變形，或病株矮化為正常株高的3/4以上；5級，1/3-1/2葉片花葉，或少數葉片變形，或主脈變黑，或病株矮化為正常株高2/3-3/4；7級，1/2-2/3葉片花葉，或變形或主側脈壞死，或病株矮化為正常株高的1/2-2/3；9級，全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，或株矮化為正常株高的1/2以上。

1.5 結果計算及統(tǒng)計方法

室內生測試驗中，統(tǒng)計處理和對照的枯斑數，計算枯斑抑制率：

枯斑抑制率(%)=(對照枯斑數-處理枯斑數)/對照枯斑數×100

田間試驗中，調查各處理的病情，計算病情指數及防效：

病情指數=∑(病級數×病株數)/(最高病級×處理總株數)×100

預防效果=(對照病指—處理病指)/對照病指×100%

治療效果=[1-(對照區(qū)藥前病指×處理區(qū)藥后病指)/(對照區(qū)藥后病指×處理區(qū)藥前病指)]×100%

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析處理，用單因素方差分析統(tǒng)計各處理平均數的差異，LSD法比較各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 VFB-1對TMV體外鈍化作用

采用半葉枯斑法測定了VFB-1在心葉煙上對TMV的鈍化作用。結果（表1）表明，VFB-1對TMV病毒粒子具有強烈的體外鈍化活性，且隨鈍化時間的延長，鈍化效果逐漸增強，50倍稀釋液鈍化5、30和60min后，抑制率分別為79.78%、82.77%和83.40%，均顯著高于相同鈍化時間下對照藥劑病毒A和VFB。

表1 VFB-1對TMV的體外鈍化作用Tab.1 Inactivation of VFB-1 to TMV in N.glutinosa at different treating times in vitro

2.2 VFB-1對TMV初侵染的抑制作用

采用半葉枯斑法測定了VFB-1對TMV初侵染的抑制作用，結果見表2。由表2可看出,VFB-1對TMV初侵染表現(xiàn)出明顯的抑制作用，施藥24h后接種，在50、100和200倍稀釋液處理后，對TMV的抑制率分別達到了69.80%、62.70%和57.85%；隨著VFB-1稀釋倍數增加，其對TMV初侵染的抑制率有所降低，但抑制率顯著高于同等稀釋倍數的VFB和對照藥劑病毒A400倍液處理。

表2 VFB-1對TMV初侵染的抑制作用Tab.2 Inhibiting infectivity of TMV in N.glutinosa by VFB-1

2.3 VFB-1對TMV復制增殖的抑制作用

采用半葉枯斑法測定了VFB-1對TMV增殖的抑制作用，結果見表3。從表3可以看出，VFB-1對TMV的復制增殖具有較好的抑制作用。接種24h后施藥，在50、100和200倍劑量下，對TMV的抑制率分別為54.07%、49.21%和45.29%，隨著稀釋倍數逐漸增大，對TMV的抑制率逐漸降低，但抑制率顯著高于同等稀釋倍數的VFB和對照藥劑病毒A 400倍液處理。

表3 VFB-1對TMV復制增殖的抑制作用Tab.3 Inhibiting multiplication of TMV in N.glutinosa by VFB-1

2.4 VFB-1對煙草花葉病毒病的盆栽藥效試驗

用 VFB-1100 倍液和VFB100倍液噴霧處理普通煙，測定其對煙草花葉病毒病的預防和治療效果。由試驗結果（表4）可以看出，VFB-1對TMV的侵染表現(xiàn)出較好的預防作用，防效達到70.23%，顯著高于VFB和對照藥劑病毒A；在治療試驗中，藥效相對一般，防效僅為35.70%，但顯著高于VFB和對照藥劑病毒A處理。

表4 VFB-1 防治煙草花葉病毒病的盆栽試驗結果Tab.4 Effect of VFB-1 against tobacco mosaic disease in pot e xperiment

2.5 VFB-1防治煙草病毒病的田間藥效試驗結果

2.5.1 預防作用

由表5可以看出，VFB-1各濃度處理對煙草病毒病均具有良好的預防作用，其100倍液對煙草病毒病的效果最好，藥后7d、14d和21d的防效分別達56.03%、55.17%和50.23%，顯著高于對照藥劑病毒A；另外，隨著VFB-1稀釋倍數的增加，VFB-1對煙草病毒病的預防作用有所降低，稀釋至400倍時，其防效高于同期病毒A處理（400倍稀釋液）和VFB 400倍液處理。

表5 VFB-1對煙草病毒病的保護作用Tab.5 Protection effect of VFB-1 against tobacco mosaic disease in field trial（Sanmenxia,Henan province,from June to August 2013）

2.5.2 治療作用

VFB-1對煙草病毒病的治療作用測定結果見表6。由表6可以看出，VFB-1對煙草病毒病表現(xiàn)出較好的治療效果。其中VFB-1100倍液在施藥后7d和14d的治療效果分別達到了41.68%和59.47%；VFB-1200倍液藥后14d的治療效果仍達49.20%，顯著高于同劑量的VFB處理及病毒A 400倍液處理。

表6 VFB-1對煙草病毒病的治療作用Tab.6 Remedial effect of VFB-1against tobacco mosaic disease i n field trial (Sanmenxia,Henan province,from June to August 20 13）

3 討論

3.1 VFB-1對煙草花葉病毒病有較好防效

近年來，生物源抗病毒劑的研發(fā)已成為抗病毒劑開發(fā)中的主流，也有部分產品獲得成功，例如殼寡糖、香菇多糖、寧南霉素等。本研究以植物源抗病毒劑VFB的升級改造產品VFB-1為材料，較為系統(tǒng)地測定了其室內外藥效。室內生測表明，VFB-1較VFB的抗TMV的活性更強；田間藥效試驗顯示，VFB-1不但對煙草病毒病具有較好的預防作用，且具有明顯的治療效果，其100倍液施藥7d和14d后的藥效分別達到了41.68%和59.47%，顯著優(yōu)于VFB原配方和病毒A。據報道，常見生物源抗病毒劑中，8% 寧南霉素1000倍液對煙草病毒病的田間預防作用約為55%，病毒豐500倍液對煙草病毒病的田間預防作用約為40%， 氨基寡糖素500倍液對煙草病毒病的田間預防作用約為35%[21-26]，而這幾種藥劑對煙草病毒病的治療效果均不理想?？梢?，VFB-1對煙草病毒病的田間預防作用要略高于病毒豐和氨基寡糖素，而弱于寧南霉素，但治療作用明顯好于這三種常見制劑。

另外，VFB-1制劑是以植物材料加工研制而成，包括馬齒莧、甘草等，其劑型也為水劑，不含任何有機溶劑，因此，該藥劑對環(huán)境、人畜應十分安全。

綜上所述，VFB具有抗病毒活性高，藥效優(yōu)良，無公害，加工材料成本低，資源豐富，加工工藝簡單等優(yōu)點，符合現(xiàn)代農藥發(fā)展方向，具有良好的開發(fā)應用潛力。

3.2 VFB-1制劑的田間應用技術需要進一步研究

科學的用藥技術包括施藥時間、施藥方式、施藥劑量、施藥次數等。本研究中，對VFB-1主要采用常量噴霧法施藥，取得了較好的防治效果，而在以往VFB的試驗中還采用灌根及灌根加噴霧等處理方法[18]。因此，對VFB-1的施藥方式還需要進一步研究。本試驗施藥時間主要在煙苗旺長期和成熟期，而沒有進行返苗期和伸根期的藥劑處理，在返苗期和伸根期施藥是否對煙草病毒病的預防效果更好，尚需進一步探討。此外，本試驗主要測定了VFB-1對煙草花葉病毒病的預防和治療效果，前期試驗表明VFB對煙草、辣椒等多種作物上的多種植物病毒病均具有良好的防效[17]，因此，還有必要開展VFB-1防治譜的研究。

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Control effect of phytogenic VFB-Ⅰagainst tobacco mosaic virus disease

CHEN Piting1，ZHENG Wei1，MA Shujie1,2，MA Zhiqing1,2，ZHANG Xing1,2
1 Research &Development Center of Biorational Pesticides,Shaanxi Research Center of Biopesticide Engineering &Technology,Yangling,Shaanxi 712100,China；
2 Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management,Ministry of Education Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling,Shaanxi 712100,China

Effect of VFB-I on tobacco mosaic virus (TMV) was evaluated with anti-TMV activities tested in vitro by local lesion.Protection and treatment efficiencies of VFB-I on TMV were evaluated by pot experiment and field plot trials.Results showed that VFB displayed significant inactivation on TMV with inhibition rate of 82.75% after mixing VFB with TMV for 0.5 h.Infection and replication of TMV to Nicotiana glutinosa were also inhibited by VFB-I,with inhibition rate of 69.80% and 54.06%,respectively.Pot experiment showed that protection efficiency of VFB-Ⅰagainst TMV disease was 70.24% and remedial efficiency was 35.71% by spraying with VFB-Ⅰ diluent of 1:100.In field trials,protection efficiency of VFB-Ⅰdiluent of 1:400 on TMV disease was higher than that of VFB,but equivalent to that of 20% moroxydine+cupric acetate WP at the same concentration.The remedial effect of VFB-Ⅰ(diluent of 1:200)was much stronger than that of 20% moroxydine+cupric acetate WP (diluents of 1:400) and VFB (diluents of 1:200).VFB-Ⅰ showed higher anti-TMV activity indicating that it is effective in controlling TMV disease.

VFB-Ⅰ；TMV； anti-virus activity； tobacco mosaic disease；botanical pesticide

陳丕庭，馬樹杰，殷培軍，等。植物源抗病毒劑VFB-1防治煙草花葉病毒病研究[J].中國煙草學報，2015,21（3）

國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（200903052）

陳丕庭（1987—），碩士研究生，主要研究方向為農藥學，Email：peiting365@163.com

馬志卿（1975—），博士，教授，主要研究方向為生物農藥研發(fā)及農藥毒理學，Email: mazhiqing2000@126.com

2014-03-07

: CHEN Piting，ZHENG Wei，MA Shujie,et al.Control effect of phytogenic VFB-Ⅰ against tobacco mosaic virus disease [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)