布圖雅， 肖 瑞， 烏日罕， 娜日格樂

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010070；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010070；3.錫盟蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特026000；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050）

蒙醫(yī)尼如哈優(yōu)化劑對結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌模型小鼠血清及結(jié)腸組織中氣體信號分子體系的影響

布圖雅1， 肖 瑞2， 烏日罕3， 娜日格樂4

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010070；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010070；3.錫盟蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特026000；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050）

目的 通過觀察蒙醫(yī)尼如哈優(yōu)化劑對氧化偶氮甲烷 （AOM）/葡聚糖硫酸鈉 （DSS）誘導(dǎo)的CAC小鼠NO、一氧化氮合酶 （iNOS）、CO、血紅素氧合酶 （HO-1）、硫化氫 （H2S）及胱硫醚-γ-裂解酶 （CSE）體系的影響，探討蒙醫(yī)尼如哈優(yōu)化劑對CAC的干預(yù)及其部分作用機(jī)制。方法 將56只Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、傳統(tǒng)組、高劑量組、中劑量組、低劑量組等，采用AOM+DSS法造模，造模完成后各組進(jìn)行相應(yīng)處理，檢測CAC小鼠血清及結(jié)腸組織中NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量。結(jié)果 模型組的NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量高于正常組，P＜0.05；高劑量組對NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的下調(diào)作用最為明顯，P＜0.017。結(jié)論 蒙醫(yī)尼如哈優(yōu)化劑可降低CAC小鼠血清及結(jié)腸組織中NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量，起到保護(hù)腸黏膜的作用。

蒙醫(yī)；尼如哈優(yōu)化劑；潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌；氣體信號分子體系

潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌（ulcerative colitis-associated cancer，CAC）是在潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）背景下發(fā)生的大腸癌即炎癥相關(guān)癌［1］，臨床資料提示其發(fā)病率目前低于結(jié)腸癌，發(fā)病率為0.6%～17%［2］，臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿便、血便為主要特征。隨著炎癥的進(jìn)展，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生癌變的危險累計率增高，病史為10、20、30年的 UC患者發(fā)生癌變的危險性依次為2%、8%、18%［3］，但是，由于UC的發(fā)病原因不明，加之目前所應(yīng)用的美沙拉嗪、5-氨基水楊酸等藥物的毒副作用較大，尋求安全有效的治療藥物及方法已成為目前研究熱點。

隨著內(nèi)源性氣體信號分子相關(guān)研究的深入，其生物學(xué)效應(yīng)越來越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，過量產(chǎn)生的NO可誘發(fā) DNA鏈斷裂、基因突變，細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生［4］，iNOS在此過程中也起主要作用［5］。正常情況下，對胃腸道運動有著調(diào)節(jié)作用的CO在腸道極少表達(dá)，只是在炎癥細(xì)胞、白介素-1等的誘導(dǎo)下，產(chǎn)生大量的CO。其主要限速酶HO-1具有抗炎癥、抗凋亡、抗增生作用，是對腸道的一種保護(hù)機(jī)制［6］。另有研究表明，高水平的H2S可能通過誘發(fā)上皮細(xì)胞的功能紊亂而促使UC的發(fā)展或腸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［7］。可見，上述氣體信號分子對結(jié)腸的炎癥及癌變都有一定影響。

CAC屬蒙醫(yī)大腸 “血痞病”范疇，即寶如熱邪易積于大腸，久病借 “赫依”之作用凝結(jié)致痞。赫依 （“氣”）與血為其主要病因。蒙醫(yī)認(rèn)為，赫依是人體賴以進(jìn)行生命活動的3種能量和基本物質(zhì)之一。從陰陽角度解釋，它有兩面性，從五元學(xué)說角度看屬 “氣”。而大腸的生理、病理改變與赫依緊密相關(guān)。盡管治療大腸病變的方藥和療術(shù)療法繁多，但均以調(diào)和赫依 （“氣”）為要?；诖耍覀?提出 “氣”與氣體信號分子具有相關(guān)性乃至對應(yīng)性的假設(shè)，采用具有軟化和消除腫瘤功效［8］的尼如哈療法 （是蒙醫(yī)的一種傳統(tǒng)外治療法，將蒙藥合理配伍成煎劑進(jìn)行灌腸治療），觀察以鎮(zhèn)赫依 （“氣”）為主要功效的尼如哈優(yōu)化劑對CAC的干預(yù)并闡明其部分作用機(jī)制，以供臨床。

通過前期研究我們發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸肉眼改變以散在、多發(fā)性息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，病理改變以低級別上皮內(nèi)瘤變和/或高級別上皮內(nèi)瘤變 （重度不典型增生及原位腺癌）為主；優(yōu)化劑低、中劑量組肉眼改變均以伴有單發(fā)或少數(shù)息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，偶伴潰瘍形成，鏡下以增生性息肉改變?yōu)橹?，偶見異常隱窩；優(yōu)化劑高劑量組肉眼改變均以結(jié)腸黏膜充血、水腫為主，鏡下改變均以黏膜上皮脫落、以腺體增生為主，未見潰瘍及明顯的異常隱窩、上皮內(nèi)瘤變。與模型組比較有極顯著差異 （P＜

0.01）。下面，我們將著重探討優(yōu)化劑對CAC小鼠結(jié)腸黏膜保護(hù)作用的部分機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性Balb/c小鼠56只，平均體質(zhì)量 （20±2）g。 （北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK［京］2009-0004）。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉 （DSS，分子量為50 000）（美國AMERESCO公司，貨號0918-10g）；氧化偶氮甲烷（AOM）（美國SIGMA公司，貨號A5486-25MG）；石蠟油（美國AMERESCO公司，貨號MJ217-100 mL）；NO試劑盒（美國RD公司，貨號DZE20293）；CO試劑盒 （南京建成生物工程研究所，貨號A101-3）；H2S試劑盒 （美國RD公司，貨號DZE20054）；iNOS試劑盒（美國RD公司，貨號DZE20450）；HO-1試劑盒 （美國 RD公司，貨號DZE20472）；CSE試劑盒 （美國 RD公司，貨號DZE20052）。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱 （DH4000A，天津泰斯特）；高速冷凍離心機(jī) （HC-3018R，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；全自動多功能酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）；MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）；紫外分光光度計（UV-2000，上海尤尼柯公司）。

1.1.4 實驗藥物及制備 尼如哈傳統(tǒng)劑，處方由訶子、茜草、枇杷葉、藜蘆、秦艽花、大黃組成，載于 《甘露四部》，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬中蒙醫(yī)院。制備法：稱重，粉碎，梯度 （100～250目孔）過篩成粉末狀，蒸餾水煮沸后靜置，取上清液備用。

尼如哈優(yōu)化劑：訶子、石榴、蓽茇等組成的15味方藥。購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬中蒙醫(yī)院。制備法同傳統(tǒng)劑。

柳氮磺吡啶腸溶片 （國藥準(zhǔn)字 H31020840，批號22120608，上海福達(dá)制藥有限公司），蒸餾水稀釋應(yīng)用。

1.2 模型建立和分組 將所有Balb/c小鼠在晝夜循環(huán)（12 h∶12 h），恒濕 （50±10）%，恒溫 （22±2）℃條件下適養(yǎng)1周。按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、傳統(tǒng)組、高劑量組、中劑量組、低劑量組等；各組8只。除空白組 （腹腔注射等量的生理鹽水）外，將質(zhì)量濃度為1 g/L溶于生理鹽水中的AOM以10 mg/kg腹腔注射一次，連續(xù)飲用一周3%DSS（分子量50 000）溶液，繼之連續(xù)喂養(yǎng)2周普通飲用水 （上述過程為一個循環(huán)），共重復(fù)三個循環(huán)［9］。

1.3 實驗方法 實驗第10周開始，將空白組與模型組給予等量的生理鹽水灌腸；柳氮磺吡啶組以3%柳氮磺吡啶灌腸；傳統(tǒng)尼如哈，450 mg/mL質(zhì)量濃度給予傳統(tǒng)組灌腸；尼如哈優(yōu)化劑分別以450、225、112.5 mg/mL給高劑量組、中劑量組、低劑量組灌腸。經(jīng)肛門插入，距肛門3 cm處注入藥物，為了使藥物充分流在結(jié)腸內(nèi)將小鼠倒立3 min。每日灌腸一次，量為0.2 mL/20 g，療程為11周。

直至療程結(jié)束后，將小鼠禁食12 h，不禁水。進(jìn)行摘眼球采血（3 500 r/min、4℃離心20 m in后取血清，儲存于-20℃），處死后取整段結(jié)腸，沿腸系膜剖開，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干后，-80℃液氮中保存。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 血清檢測 CO的量測定：采用比色法。NO及H2S的量測定：采用酶聯(lián)免疫法。

1.4.2 組織檢測 從液氮中取出結(jié)腸組織，按照10%（10 mg組織加入100μL生理鹽水）勻漿，以3 500 r/min、4℃離心取上清，采用酶聯(lián)免疫法檢測iNOS、HO-1、CSE等的量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件使用秩和檢驗處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均用表示。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清NO、CO、H2S含有量的比較（）

表1 各組小鼠血清NO、CO、H2S含有量的比較（）

注：與空白組比較，★P＜0.05；各治療組與模型組比較，☆P＜0.05；各劑量優(yōu)化劑之間比較，▲P＜0.05；傳統(tǒng)組與優(yōu)化劑組比較，△P＜0.05；柳氮磺吡啶組與優(yōu)化劑組、傳統(tǒng)組比較，●P＜0.05

組別 動物數(shù) NO/（μmol·L-1） CO/（μmol·L-1） H2S/（pg·mL-1）2.03±0.75 0.71±0.25 5.00±0.83模型組 8 10.14±1.70★ 1.34±0.63★ 34.17±6.54★優(yōu)化劑低劑量組 8 8.42±0.80☆ 1.01±0.50 23.93±6.40☆優(yōu)化劑中劑量組 8 7.68±0.83☆ 0.77±0.28☆▲△● 17.45±2.95☆優(yōu)化劑高劑量組 8 6.99±0.34☆▲ 1.36±0.47 10.36±1.29☆▲△尼如哈傳統(tǒng)劑組 8 8.14±1.58☆ 1.18±0.41 18.04±7.30☆柳氮磺吡啶組 8 6.08±2.15☆ 0.77±0.44 7.85±4.34空白組8☆●

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化劑對CAC小鼠血清NO、CO、H2S及小鼠結(jié)腸組織iNOS、HO-1、CSE的影響 見表1、2。

2.1.1 模型組與空白組相比較，模型組的H2S、CSE、CO、NO、iNOS、HO-1含有量高于空白組（P＜0.05）。說明在CAC病變中H2S、CSE、CO、NO、iNOS、HO-1表達(dá)顯著增加。

2.1.2 各治療組與模型組比較，模型組H2S、CSE、NO、 iNOS、HO-1的量高于各治療組 （P＜0.05），說明各治療組對H2S、CSE、NO、iNOS、HO-1的量表達(dá)均有明顯作用。模型組CO的量高于中劑量組 （P＜0.05），說明只有中劑量優(yōu)化劑組具有下調(diào)CO含有量的作用。

2.1.3 不同劑量優(yōu)化劑組間多重比較，中劑量組對CO的作用最為顯著 （P＜0.05），說明高劑量作用顯著；高劑量組對 H2S、CSE、NO、iNOS、HO-1的影響最為顯著（P＜0.05）。

表2 各組小鼠腸組織iNOS、HO-1、CSE含有量的比較

2.1.4 優(yōu)化劑與傳統(tǒng)組比較，中劑量組對CO調(diào)控的作用優(yōu)于傳統(tǒng)組 （P＜0.05）；高劑量組對HO-1的調(diào)控作用優(yōu)于傳統(tǒng)組 （P＜0.05）；高劑量組對H2S的調(diào)控作用優(yōu)于傳統(tǒng)組 （P＜0.05），說明優(yōu)化劑作用優(yōu)于傳統(tǒng)劑。

2.1.5 各組與柳氮磺吡啶組相比，高劑量組對HO-1的作用高于柳氮磺吡啶組 （P＜0.05）；中劑量組對CO的作用高于柳氮磺吡啶組 （P＜0.05），說明優(yōu)化劑較柳氮磺吡啶作用顯著。

3 討論

20世紀(jì)80年代中期，被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性氣體分子NO代表一種新型的非受體依賴性信號傳導(dǎo)機(jī)制，開創(chuàng)了新的研究領(lǐng)域 “氣體信號分子”，繼NO之后，CO和H2S也被發(fā)現(xiàn)［10］。它們具有分子量小、持續(xù)產(chǎn)生、彌散迅速及作用廣泛等特點，并能自由通過各種生物膜，相互作用，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［11］，在許多的研究中已被證實和炎性反應(yīng)有著密切的關(guān)系，并且通過干預(yù)和調(diào)節(jié)NO、CO、H2S在炎癥反應(yīng)中的表達(dá)，可以明顯減輕炎癥反應(yīng)損傷［12］。研究表明慢性炎癥常繼發(fā)腫瘤，而腫瘤組織活檢樣本中也尚存炎癥細(xì)胞，證實炎癥反應(yīng)參與腫瘤形成［13］。所以通過減輕炎癥反應(yīng)可干預(yù)其癌變進(jìn)展。

我們通過本實驗發(fā)現(xiàn)，CAC小鼠NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量顯著升高，符合上述指標(biāo)在CAC病變中的量變化規(guī)律。而優(yōu)化劑高劑量組對NO、iNOS、HO-1、H2S及CSE下調(diào)作用顯著，中劑量組對CO具有下調(diào)作用。說明優(yōu)化劑可有效抑制CAC小鼠血清及結(jié)腸組織中的氣體信號分子的產(chǎn)生。降低NO的量，可降低腫瘤的發(fā)生風(fēng)險，抑制iNOS的過分表達(dá)，可消除其在NO介導(dǎo)的促瘤作用。調(diào)控CO及HO-1，可發(fā)揮其抗炎、抗凋亡、抗增生作用，保護(hù)腸道。而降低H2S含有量，可干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展或腸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化?？梢哉f，尼如哈優(yōu)化劑是通過下調(diào)CAC小鼠NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量，進(jìn)而起到了保護(hù)結(jié)腸黏膜，干預(yù)CAC病變發(fā)展的作用。

該實驗是通過實驗方法驗證蒙醫(yī)藥對CAC防治作用的初次嘗試，也是蒙醫(yī)理論之 “氣”與氣體信號分子相關(guān)性的粗淺探討，但還需更多、更深入系統(tǒng)的臨床及實驗研究的驗證。筆者認(rèn)為，在闡明 “氣”與氣體信號分子內(nèi)在聯(lián)系的基礎(chǔ)上，立足于蒙醫(yī)基礎(chǔ)理論，應(yīng)用毒副作用相對較小的天然蒙藥，在防治CAC臨床中起到輔助作用，提高患者生活質(zhì)量，具有實際意義。

［1］ 唐 凱，王建國.炎癥性腸病并發(fā)結(jié)直腸癌的相關(guān)研究動態(tài)［J］.全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2010，8（6）：647-650.

［2］ 王國品，徐肇敏.潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌研究進(jìn)展［J］.中華消化內(nèi)鏡雜志，2011，18（3）：190-192.

［3］ 徐春曉，張 艷，朱益民.炎癥在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用機(jī)制［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013，34（1）：78-81.

［4］ 張洪海，要根東.一氧化氮與疾病發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2001，7（12）：716-717.

［5］ 王 艷，丁 虹，肖庚富.一氧化氮介導(dǎo)的腫瘤治療研究進(jìn)展［J］.癌癥，2008，（4）：476-479.

［6］ 朱曙光，鄭 勇，孔 維，等.誘導(dǎo)型血紅素氧合酶在腹瀉型腸易激綜合征患者中的表達(dá)［J］.石河子大學(xué)學(xué)報，2005，23（6）：711-714.

［7］ 陳 雯，謝曉華.新型氣體信號分子硫化氫的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2004，14（24）：3704-3709.

［8］ 蘇德巴彥爾，烏敦高娃.淺析蒙醫(yī)藥治療腫瘤病的方法［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7（12）：76-77.

［9］ Neufert C，Becker C，Neurath M F.An induciblemousemodel of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression［J］.Nat Protoc，2007，2（8）：1998-2004.

［10］ 金紅芳，杜軍保，唐朝樞.氣體信號分子在心血管疾病發(fā)病中的意義［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2005.27（4）：518-524.

［11］ 谷萬里，史載祥.氣體信號分子與血瘀證研究的再深入［C］.//慶祝中國中醫(yī)研究院成立50周年首屆中醫(yī)藥發(fā)展國際論壇暨首屆中醫(yī)藥防治艾滋病國際研討會論文集，2005：892-896.

［12］ 趙華棟.辛伐他汀對脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞氣體信號分子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的作用研究［D］石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

［13］ 吉登波，崔景榮.腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療與炎癥的關(guān)系［J］.中國新藥雜志，2010，19（17）：1551-1555.

R285.5

B

1001-1528（2015）12-2746-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.037

2014-07-14

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目 （kjt11sf07）

布圖雅 （1973-），女 （蒙古族），博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事蒙醫(yī)腸療治療潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的臨床與實驗研究。Tel：13354711577，E-mail：butuyatl@126.com