羅銀河， 葛金文*， 劉 林

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007）

［科研報(bào)道］

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PAI-1、tPA、ICAM 1、VCAM 1表達(dá)的影響

羅銀河1， 葛金文1*， 劉 林2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007）

目的 探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯 （BYHWT）對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞 （MCAO）大鼠不同時(shí)間點(diǎn)纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）、組織型纖溶酶原激活物（tPA）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）和血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM1）表達(dá)的影響。方法 用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，觀察缺血后1、3、7 d神經(jīng)癥狀積分，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血漿中PAI-1、tPA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)腦組織中ICAM1、VCAM1蛋白質(zhì)表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量法（RT-PCR）測(cè)定腦組織中Icam1、Vcam1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組神經(jīng)癥狀積分（7 d）低于模型組和依達(dá)拉奉組 （P＜0.01）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿PAI-1表達(dá)在腦缺血后3 d比依達(dá)拉奉組明顯降低 （P＜0.01）；依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿tPA表達(dá)在缺血后3、7 d比假手術(shù)組明顯降低 （P＜0.01）；假手術(shù)組、依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織Icam1、Vcam1 mRNA的表達(dá)在腦缺血后1、3、7 d比模型組均明顯降低 （P＜0.01），ICAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后3、7 d比模型組明顯降低 （P＜0.01）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織VCAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后1、3、7 d比模型組明顯降低 （P＜0.01）。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯下調(diào)PAI-1、上調(diào)tPA的表達(dá)，降低黏附分子，PAI-1在治療后3 d降低最明顯，tPA在治療后1 d升高最明顯，黏附分子在治療后7 d降到最低值。從而有效控制血栓的形成，抑制炎性細(xì)胞的黏附、聚集和激活，拮抗缺血性腦損傷，保護(hù)腦組織。

大腦中動(dòng)脈栓塞 （MCAO）；細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）；血管細(xì)胞間黏附分子1（VCAM1）；纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）；組織型纖溶酶原激活物（tPA）

血漿纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）和組織型纖溶酶原激活物 （tPA）是纖溶系統(tǒng)的一對(duì)關(guān)鍵物質(zhì)，它們之間的動(dòng)態(tài)平衡，能有效地清除體內(nèi)纖維蛋白凝塊，防止血栓形成。細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）和血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM1）在腦缺血炎癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。腦缺血后ICAM1和VCAM1表達(dá)增加，與白細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，從而導(dǎo)致白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、游出，進(jìn)而浸潤(rùn)到血管外腦實(shí)質(zhì)，導(dǎo)致缺血后炎癥。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療氣虛血瘀型腦卒中的經(jīng)典名方，臨床報(bào)道補(bǔ)陽(yáng)還五湯可提高血小板功能，改善患者異常的血小板活化和纖溶活性，改善其不良血液循環(huán)狀態(tài)［1］。高、中、低劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯均能減少血瘀證大鼠VCAM1的表達(dá)，高劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著減少ICAM1表達(dá)，而中、低劑量組表達(dá)反而增加［2］。近年來(lái)，對(duì)本方不同劑量對(duì)血瘀證模型大鼠纖溶系統(tǒng)及黏附分子的影響等方面開展了大量的實(shí)驗(yàn)研究，但尚未見本方對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)纖溶系統(tǒng)及黏附分子表達(dá)影響的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA、Western blot和RT-PCR方法，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血后大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PAI-1、tPA、ICAM1、VCAM1表達(dá)規(guī)律，探討其腦保護(hù)的最佳時(shí)間點(diǎn)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～300 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠喂養(yǎng)，每籠5只。

1.2 藥物 補(bǔ)陽(yáng)還五湯 （出自 《醫(yī)林改錯(cuò)》）由生黃芪120 g，赤芍5 g，川芎3 g，當(dāng)歸尾6 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g組成。購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)鑒定符合 《中華人民共和國(guó)藥典》2005年的規(guī)定。將飲片分煎兩次后混合，濃縮至含生藥1 g/mL的湯劑冷藏備用。依達(dá)拉奉購(gòu)自吉林博大制藥有限公司，規(guī)格15 g/10 mL，批號(hào)02-140716。

1.3 主要試劑 TRIZOL試劑（美國(guó)BIOMIGA公司）；DEPC（美國(guó)Amresco公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Mix（美國(guó)GeneCopoeia公司）；三氯甲烷、異丙醇、

無(wú)水乙醇 （上海生工生物有限公司）；分離膠、濃縮膠、蛋白裂解液、5×SDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液（北京Lifeman生化股份有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 （貨號(hào)P0010，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；羊抗鼠二抗 （貨號(hào)CW0102，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；羊抗兔二抗 （貨號(hào)CW0103，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；ECL發(fā)光液（貨號(hào)K-12045-D50，美國(guó)Advansta公司）；大鼠PAI-1、tPA、ICAM1、VCAM1試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.4 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（型號(hào)YXQ-LS-SⅡ，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)101-1AB，天津市泰斯特儀器有限公司）；-80℃超低溫冰箱（型號(hào)DW-HL538，中科美菱低溫科技股份有限公司）；低溫臺(tái)式高速離心機(jī) （型號(hào)HR/T 16M，赫西儀器裝備有限公司）；電泳儀 （型號(hào)DYY-2C，北京六一生物科技有限公司）；定量PCR儀（型號(hào)StepOneTMReal-Time PCR System，Life Technologies）；水平搖床（型號(hào)WD-9405B，北京六一生物科技有限公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) （型號(hào)Tanon5500，上海天能科技有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （型號(hào)5424R，Eppendorf）；超純水儀 （型號(hào)SIMSV0000，美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 模型制備 參照Z(yǔ)ea Longa等［3］建立的大鼠大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷方法，作適當(dāng)改進(jìn)。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)10%水合氯醛 （0.35 g/kg）腹腔注射麻醉，保留自主呼吸，仰臥位固定，術(shù)中體溫由肛溫計(jì)監(jiān)測(cè)，并用白熾燈加熱維持肛溫在36.5～37℃，防止低溫對(duì)腦缺血的影響。頸部正中切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。分離頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈，仔細(xì)分離避免損傷迷走神經(jīng)和氣管，置線備用。結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，于頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈處用動(dòng)脈夾夾閉，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，將尼龍線由頸外動(dòng)脈插入，插入后用0號(hào)絲線結(jié)扎，以防止出血，打開頸內(nèi)動(dòng)脈處動(dòng)脈夾，將尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度約 （18.5±0.5）mm至微感阻力，固定線栓，逐層縫合，尼龍線殘端留l cm長(zhǎng)于皮外。手術(shù)后動(dòng)物保溫 （28℃左右）飼養(yǎng)。動(dòng)物造模清醒后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分［4］，分值在1～3分者入組。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離右頸總動(dòng)脈后即縫合。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組，每組15只。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組于術(shù)后6 h起灌服24 mL/kg補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液（按體表面積計(jì)算，相當(dāng)人臨床等效劑量的2倍，12.87 g/kg）；依達(dá)拉奉組于術(shù)后6 h腹腔注射依達(dá)拉奉3 mg/（kg·d），分2次注射；模型組和假手術(shù)組動(dòng)物均給予等量生理鹽水，自由飲食、活動(dòng)。

2.3 神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分方法 參考Bederson［4］的5分制法在動(dòng)物麻醉清醒后24 h首次進(jìn)行評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀。1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪。2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分：向?qū)?cè)傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分值越高，說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。腦缺血后3、7 d按同樣方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分。

2.4 標(biāo)本采集及處理 分別于首次給藥后1、3、7 d各組取5只大鼠，10%水合氯醛 （0.35 g/kg）腹腔注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血5 mL置于0.109 mmol/L（1∶9抗凝）的枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，混勻，靜置30 min，離心，及時(shí)分離血漿，置于-80℃低溫冰箱中保存待用。備皮消毒后，斷頭，分離大腦，迅速放至液氮中速凍，再移入-80℃冰箱保存。

2.5 檢測(cè)方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血漿中PAI-1、tPA的量，RT-PCR方法檢測(cè)腦組織Icam1、Vcam1 mRNA，Western blot方法測(cè)定腦組織ICAM-1、VCAM-1蛋白的量，均按試劑盒 （武漢博士德生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書操作。

2.6 腦組織Icam1、Vcam1引物的設(shè)計(jì) 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找基因序列，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物序列如下，見表1。

表1 RT-PCR的引物序列

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)癥狀積分變化的影響 腦缺血后3 d，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組較模型組同時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)癥狀積分明顯降低 （P＜0.05）；腦缺血后7 d，依達(dá)拉奉組較模型組同時(shí)間點(diǎn)積分明顯降低 （P＜0.05）；腦缺血后7 d，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組的積分低于模型組和依達(dá)拉奉組（P＜0.01）。見表2。

表2 各組神經(jīng)癥狀積分

3.2 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠血漿PAI-1、tPA的表達(dá) 腦缺血后3、7 d，假手術(shù)組、依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組較模型組相同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿PAI-1表達(dá)降低；腦缺血后1、7 d，假手術(shù)組、依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組較模型組相同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿tPA表達(dá)升高（P＜0.01）；與依達(dá)拉奉組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿PAI-1水平在腦缺血后3 d明顯降低（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿PAI-1表達(dá)在缺血后7 d有顯著性差異（P＜0.01），tPA表達(dá)在缺血后3、7 d有顯著性差異（P＜0.01）。見表3。

表3 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠血漿PAI-1、tPA的表達(dá)（n=5，）（ng/m L）

表3 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠血漿PAI-1、tPA的表達(dá)（n=5，）（ng/m L）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與依達(dá)拉奉組比較，★P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▲P＜0.01

PAI-1 tPA組別1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 9.9±1.7 7.7±3.7△ 5.9±0.66△ 4.3±1.3△ 4.1±0.3 4.2±0.3△模型組 10.1±1.5 12.8±1.4 11.9±1.4 1.4±0.1 1.9±0.7▲ 0.9±0.1依達(dá)拉奉組 7.9±3.7 9.5±0.7△ 7.4±0.2△▲ 3.5±0.3△ 1.0±0.2▲ 2.5±0.2△▲補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 9.9±3.5 6.6±0.3△★ 8.8±1.5△▲ 3.7±0.2△ 1.6±0.3▲ 2.8±0.4△▲

3.3 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織Icam1、Vcam1 mRNA的表達(dá) Quantity one軟件分析不同組別不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織Icam1、Vcam1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：與模型組比較，假手術(shù)組、依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組Icam1、 Vcam1 mRNA的表達(dá)在腦缺血后1、3、7 d均明顯降低（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組Icam1 mRNA在缺血后1、3 d有顯著性差異（P＜0.01）。RT-PCR定量分析結(jié)果見表4。

表4 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠腦組織Icam1、Vcam1 m RNA的表達(dá)（n=5，）

表4 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠腦組織Icam1、Vcam1 m RNA的表達(dá)（n=5，）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▲P＜0.01

Vcam1組別 Icam1 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 1.9±0.1△ 1.7±0.2△ 2.0±0.3△ 3.1±0.4△ 2.6±0.4△ 2.7±0.4△模型組 7.2±0.5 8.1±0.6 8.8±0.5 5.1±0.3 5.9±0.6 7.9±1.0依達(dá)拉奉組 3.4±0.4△▲ 3.5±1.2△▲ 2.3±0.3△ 3.2±0.4△ 2.9±0.5△ 2.2±0.3△補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 3.3±0.1△▲ 2.9±0.3△▲ 1.8±0.4△ 2.7±0.6△ 2.4±0.5△ 1.6±0.4△

3.4 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織ICAM1、VCAM1蛋白的表達(dá) Quantity one軟件分析不同組別不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織ICAM1、VCAM1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：與模型組比較，假手術(shù)組、依達(dá)拉奉組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織ICAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后3、7 d明顯降低 （P＜0.01）；與依達(dá)拉奉組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織ICAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后7 d明顯降低 （P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織VCAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后1、 3、7 d明顯降低 （P＜0.01），假手術(shù)組大鼠腦組織VCAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后1、3、7 d明顯降低 （P＜0.01），依達(dá)拉奉組大鼠腦組織VCAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后7 d明顯降低 （P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織VCAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后1 d有顯著性差異 （P＜0.01），依達(dá)拉奉組大鼠腦組織VCAM1蛋白表達(dá)在腦缺血后1、3、7 d有顯著性差異 （P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示見表5。

表5 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠腦組織ICAM 1、VCAM 1蛋白的表達(dá) （n=5，）

表5 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)局灶性腦缺血大鼠腦組織ICAM 1、VCAM 1蛋白的表達(dá) （n=5，）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與依達(dá)拉奉組比較，★P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▲P＜0.01

ICAM1 VCAM1組別1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 34.4±5.8 34.4±2.5△ 34.3±6.2△ 19.5±2.1△△ 19.2±2.9△ 19.5±1.9△模型組 47.6±1.9 51.1±1.2 63.3±3.6 30.2±1.7▲ 33.9±4.4 39.7±3.9依達(dá)拉奉組 43.9±2.8 39.2±6.1△ 39.5±2.9△ 28.3±1.5▲ 27.0±2.4▲ 24.7±1.9△▲補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 39.5±7.6 37.3±4.9△ 27.6±1.5△★ 24.7±1.9△▲ 23.8±2.6△ 16.6±4.4△

4 討論

tPA和PAI-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，tPA是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的重要組成部分，能夠轉(zhuǎn)化纖溶酶原成為具有催化作用的纖溶酶，PAI-1主要功能是阻止tPA激活纖溶酶原，局部的纖溶系統(tǒng)平衡取決于局部tPA和PAI-1的量，tPA和PAI-1能夠在體內(nèi)以1∶1的比例形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而維持纖溶系統(tǒng)平衡［5］。體內(nèi)纖溶活性的降低是血栓形成的主要原因。內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放tPA減少、PAI-1的合成和釋放增加是心腦血管病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素［6］。在血栓形成不同時(shí)間段，血漿tPA及PAI活性存在著規(guī)律性變化。在血栓形成最初24 h內(nèi)，血漿tPA活性明顯降低，而血漿PAI活性明顯升高［7］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯有抗凝血酶、抑制血小板聚集、促進(jìn)血栓溶解的作用，對(duì)血液凝固有較強(qiáng)的抑制作用［8］。

ICAM1和VCAM1是兩種重要的黏附分子，同屬免疫球蛋白超家族成員，在腦缺血損傷炎癥過(guò)程中起著重要作用。它們共同介導(dǎo)炎癥發(fā)生前白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、聚集及浸潤(rùn)過(guò)程，在這種反復(fù)黏附和脫離過(guò)程中，白細(xì)胞

與趨化因子或CD31等活性分子的接觸激活了白細(xì)胞的黏附活性，從而使ICAM1，ICAM2，VCAM1等黏附分子更易于與之結(jié)合，為白細(xì)胞更牢固結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞和介導(dǎo)它們遷入內(nèi)皮下參與各種生理病理過(guò)程創(chuàng)造了條件［9］。本研究發(fā)現(xiàn)：局灶性腦缺血大鼠腦組織VCAM1、Vcam1 mRNA、ICAM1和Icam1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。因此，抑制ICAM1和VCAM1的表達(dá)或阻斷表達(dá)后與白細(xì)胞表面黏附受體的結(jié)合，均可減輕腦缺血炎癥，改善神經(jīng)功能，預(yù)防和治療腦缺血損傷［10］。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代王清任 《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功效，主治氣虛血瘀之中風(fēng)。中風(fēng)半身不遂，一屬中氣不足則邪氣中之，二屬肝血瘀滯經(jīng)絡(luò)不暢，氣虛血瘀發(fā)為半身不遂。治宜補(bǔ)氣活血為法。氣虛屬脾，故方中重用生黃芪120 g補(bǔ)中益氣為主；血瘀屬肝，除風(fēng)先活血，故配伍當(dāng)歸尾、川芎、桃仁、赤芍、紅花入肝，行瘀活血，疏肝祛風(fēng)；加入地龍活血而通經(jīng)絡(luò)。共成補(bǔ)氣活血通絡(luò)之劑。據(jù)現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，黃芪主要含有黃芪皂苷類、多糖類、黃酮類、氨基酸類及少量微量元素類，黃芪皂苷對(duì)腦血管系統(tǒng)和血液流變性均有影響［11］。當(dāng)歸多糖及其硫酸酯可顯著延長(zhǎng)凝血時(shí)間、縮短出血時(shí)間；顯著延長(zhǎng)凝血酶時(shí)間和活化部分凝血活酶時(shí)間，其抗凝血作用主要是影響內(nèi)源性凝血系統(tǒng)［12］。紅花中紅花黃素對(duì)內(nèi)源性和外源性凝血有明顯的抑制作用，對(duì)凝血過(guò)程諸多環(huán)節(jié)如血小板黏附、血栓形成和纖維蛋白交聯(lián)等有抑制作用［13］。以往的補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦血管疾病的實(shí)驗(yàn)研究表明：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯降低腦缺血再灌注大鼠腦組織黏附分子表達(dá)，有效抑制炎性細(xì)胞的黏附、聚集和激活，拮抗缺血性腦損傷［14］。但大多忽視了腦血管疾病中時(shí)間因素的重要性。因此，本研究觀察不同時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠tPA、PAI1、ICAM1、VCAM-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療腦梗死的作用，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明：補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯降低血漿PAI-1水平，升高tPA水平，降低黏附分子表達(dá)，血漿PAI-1水平在治療后3 d降低最明顯，tPA水平在治療后1 d升高最明顯，黏附分子7 d降到最低值。說(shuō)明纖溶抑制減弱，纖溶酶原激活增強(qiáng)，血栓形成的傾向性降低。從而有效防止血栓形成，抑制炎性細(xì)胞的黏附、聚集和激活，拮抗缺血性腦損傷。

綜上所述，大鼠局灶性腦缺血后，血漿PAI-1升高，tPA明顯減低，腦組織中VCAM1、ICAM1蛋白及其mRNA表達(dá)有不同程度的增強(qiáng)，調(diào)控腦缺血時(shí)tPA、PAI1、VCAM1、ICAM-1的表達(dá)及作用可防止血栓形成，減輕腦缺血炎癥，保護(hù)腦缺血損傷。具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效的補(bǔ)陽(yáng)還五湯可明顯降低血漿PAI-1，升高tPA水平，結(jié)果表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療局灶性腦缺血后，內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放tPA明顯增加，激活血凝塊中的纖溶酶原生成纖溶酶，

從而促使血栓中的纖維蛋白凝塊溶解，PAI-1水平逐漸降低，與tPA的結(jié)合減少，纖溶活性增強(qiáng)，防止血栓形成。同時(shí)補(bǔ)陽(yáng)還五湯抑制VCAM1、ICAM1蛋白及其mRNA的表達(dá)，給藥7 d抑制作用最明顯，從而發(fā)揮拮抗腦缺血損傷作用。

［1］ 趙玉霞，楚中華，孔令鈞.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)中風(fēng)患者血小板及纖溶活性的影響［J］.山東中醫(yī)雜志，2001，20（5）：336-337.

［2］ 陳利國(guó)，屈 援，葛紅穎.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血瘀證大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響［J］.中草藥，2005，36（5）：706-708.

［3］ Longa Z，Winstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occulasion cranjectomy without in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84.

［4］ Bederson JB，Pitts L H，German S M，et al.Evaluation of 2.3.5-triphenyhetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats［J］. Stroke，1996，17（6）：1034-1038.

［5］ Herberlein K R，Straub A C，Best A K，etal.Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation［J］.Circ Res，2010，106（6）：1092-1102.

［6］ Chia S，Ludlam C A，F(xiàn)ox K A，et al.Acute systemic inflammation enhances endothelium dependent tissue plasminogen activator release in men［J］.Am Coll Cardiol，2003，41（2）：333-339.

［7］ 龍 潔，曲 輝，白 云，等.腦血栓形成患者血漿組織型纖溶酶原激活物及其快速抑制物的變化及臨床意義［J］.中華神經(jīng)科學(xué)雜志，1998，31（5）：267-269.

［8］ 賀石林.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血液凝固影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，9（4）：212.

［9］ Hubbard A K，Rothlein R.Intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）expression and cell signaling cascades［J］.Free Radic Biol Med，2000，28（9）：1379-1386.

［10］ 張麗慧，魏爾清.ICAM-1、VCAM-1在腦缺血損傷炎癥機(jī)制中的作用及調(diào)控［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（11）：1281-1285.

［11］ Chen X J.A comparative study on the therapeutic efect of astragaloside and perindoprilin treating CVB3 infected cardiomyocytes in rats［J］.CJIM，2001，7（1）：39-42.

［12］ 楊鐵虹，商 澎，梅其炳.當(dāng)歸多糖硫酸酯對(duì)凝血和血小板聚集的作用［J］.中草藥，2002，33（11）：1010-1013.

［13］ 裴水娜.紅花的藥理作用和臨床應(yīng)用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（2）：144-146.

［14］ 高劍峰，王曉輝，劉 軻，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注腦組織TNF-α、ICAM-1和VCAM-1表達(dá)變化的影響［J］.中醫(yī)臨床版.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，15（4）：1-4.

R285.5

B

1001-1528（2015）12-2739-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.035

2015-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81274008）

羅銀河 （1978—），女，副教授，博士生，主要從事心腦血管疾病方面研究。Tel：13574891189，E-mail：1286313109@ qq.com

*通信作者：葛金文（1965—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究中醫(yī)藥防治心腦血管疾病。E-mail：cmgjw@tom.com