羅 蘭， 張素中*， 黃月純， 盧小燕， 黃燕媚， 邵華宇

（1.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東廣州510520；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

廣金錢草總黃酮成分不同提取方法的比較

羅 蘭1， 張素中1*， 黃月純2， 盧小燕1， 黃燕媚1， 邵華宇1

（1.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東廣州510520；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

目的 比較不同方法提取廣金錢草中總黃酮成分的效果。方法 以總黃酮提取率及HPLC指紋圖譜評價水提法、醇提法、酶解法和半仿生法提取廣金錢草的效果，紫外分光光度法測定總黃酮含有量，HPLC指紋圖譜共有模式評價各提取液中黃酮類共有成分的變化。結(jié)果 酶解法與醇提法的總黃酮得率都較高，其中前者對廣金錢草的特征成分夏佛塔苷的提取效果更好，而水提法與半仿生法的提取效果較差，尤以后者為甚。結(jié)論 4種提取方法的效果依次為酶解法＞醇提法＞水提法＞半仿生法。

廣金錢草；總黃酮；水提法；醇提法；酶解法；半仿生法

廣金錢草為豆科植物廣金錢草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分，具有利濕退黃、利尿通淋的功效，主治黃疸尿赤、熱淋、石淋、小便澀痛、水腫尿少［1］，主要分布于廣東、廣西、云南、四川、福建等地，生于山坡、草地、土坎或灌木叢中，是兩廣地區(qū)大宗栽培的藥材。目前，已經(jīng)有多種提取廣金錢草總黃酮成分的方法［2-6］，其中水提法和醇提法最常用［7-11］，但由于存在細胞壁，故提取過程不完全，而酶解法和半仿生法都能破壞細胞壁，提高有效成分的提取率，具有很大的應(yīng)用價值［12-16］，但至今仍鮮有相關(guān)的研究報道［17］。本實驗分別采用水提法、醇提法、酶解法和半仿生法來提取廣金錢草總黃酮成分，然后通過紫外分光光度法和高效液相色譜法進行檢測，從而選出最優(yōu)的方法，為廣金錢草制劑的生產(chǎn)以及相關(guān)工藝的研究提供實驗基礎(chǔ)和參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 廣金錢草 （清平市場和藥店，共10批，批號分 別 為 100311、 100517、 101027、 100621、 100328、100910、100705、100612、100726、101008，產(chǎn)地廣西），經(jīng)中山大學(xué)新華學(xué)院張素中副教授鑒定為豆科植物廣金錢草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分。

1.2 試劑 蘆丁對照品 （純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所，批號10080-200707）；纖維素酶 （酶活力20 000 U/g，北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司）。所用試劑均為分析純。

1.3 儀器 UV-1102型紫外分光光度計 （上海天美科學(xué)儀器有限公司）；CJS80型高效粗粉機 （江陰市優(yōu)協(xié)機械制造有限公司）；電熱恒溫水浴鍋 （上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；FA2004N型電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器 （金壇市宏華儀器廠）；Agilent 1200 HPLC色譜儀，包括四元梯度泵、柱溫箱、二級管陣列檢測器、紫外檢測器、Chemstation工作站（美國安捷倫科技公司）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 不同提取方法提取液的制備

2.1.1 水提法提取液的制備 稱取干燥廣金錢草粗粉 （過20目篩）10 g，加水100 mL，浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 m in，趁熱用4層紗布濾過，藥渣加水100 mL，煮沸后再慢煎30 min，趁熱濾過，合并兩次煎液，濃縮到20 m L，50%甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.1.2 醇提法提取液的制備 稱取干燥廣金錢草粗粉 （過20目篩）10 g，加65%乙醇100 mL，回流兩次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并兩次提取液，濃縮到20 mL，50%甲醇溶解并定容至50mL，即得。

2.1.3 酶解法提取液的制備 稱取干燥廣金錢草粗粉 （過20目篩）10 g，加10倍量水混勻，再加入纖維素酶0.06 g，酶解1 h（溫度50℃、pH為6），然后用相對于粗粉6倍量的80%乙醇溶液提取1 h，冷卻濾過，藥渣加5倍量60%乙醇回流30 min，冷卻濾過，棄去藥渣，合并提取液，濃縮到20mL，50%甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.1.4 半仿生法提取液的制備 稱取干燥廣金錢草粗粉（過20目篩）10 g，選擇pH為2.2的磷酸氫二鈉緩沖液100 mL作為浸取劑，模擬胃腸道pH，40℃下回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮到20 mL，50%甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.2 不同提取工藝的提取率比較分析

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取在120℃下干燥至恒重的蘆丁標準品20.60 mg，置于50 mL量瓶中，加入60%乙醇適量，置水浴上微熱溶解，放冷后以60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取25 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含蘆丁0.206mg的對照溶液。

2.2.2 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液3 mL，置于25m L量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 m in，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6min。然后，加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，按紫外分光光度法進行掃描。結(jié)果顯示，在508 nm處有最大吸收，故確定檢測波長為508 nm。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，置于25 m L量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 m in，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。然后，加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在508 nm波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度 （G）為縱坐標 （y），吸光度 （A）為橫坐標 （x），繪制標準曲線，得回歸方程y=8.771 9x+ 0.013，r2=0.999 8。

2.2.4 供試品的制備 分別取 “2.1”項下4種提取液適量，過濾，吸取續(xù)濾液15 mL，適當濃縮，50%甲醇定容至5mL，即得。

2.2.5 總黃酮提取率的測定 取各供試品適量，過濾，取續(xù)濾液4.0 mL，置于10 mL量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度。再精密量取稀釋液1 mL，置于25 mL量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。然后，加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，在508 nm波長處測定吸光度，利用標準曲線計算樣品的總黃酮提取率，計算公式為

注：G為標準曲線上的黃酮含有量；D為稀釋倍數(shù)；V為樣液體積；W為廣金錢草粗粉質(zhì)量

2.2.6 實驗結(jié)果與分析 各批次總黃酮提取率見表1，然后以酶法提取為基準，比較相對提取率，見表2。由表可知，酶解法與醇提法的總黃酮提取率較高，并且其差異不明顯，而半仿生與水提法則較低，也無明顯差異，并且均只相當于酶解法與醇提法的75%左右。

表1 4種提取方法的總黃酮提取率

表1 4種提取方法的總黃酮提取率

批次 水提法/% 醇提法/% 酶解法/% 半仿生法/% 1 0.346±0.008 0.408±0.008 0.438±0.008 0.357±0.009 2 0.343±0.005 0.466±0.009 0.563±0.009 0.413±0.011 3 0.375±0.007 0.352±0.007 0.470±0.011 0.243±0.011 4 0.345±0.008 0.330±0.007 0.441±0.009 0.224±0.009 5 0.386±0.009 0.398±0.005 0.483±0.004 0.292±0.007 6 0.333±0.010 0.476±0.005 0.447±0.005 0.380±0.009 7 0.457±0.006 0.550±0.009 0.538±0.007 0.443±0.008 8 0.452±0.008 0.584±0.003 0.542±0.002 0.485±0.004 9 0.377±0.005 0.473±0.010 0.475±0.005 0.417±0.003 10 0.382±0.003 0.460±0.008 0.477±0.009 0.364±0.009

表2 4種提取方法的總黃酮相對提取率

3 廣金錢草工藝的指紋圖譜評價

3.1 色譜條件 Zorbax SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈 -0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～30 min，12%→14%乙腈；30～40 min，14%→16%乙腈；40～55 m in，16%→25%乙腈）；檢測波長為270 nm；柱溫為40℃；體積流量為1mL/min。

3.2 供試品溶液的制備 同 “2.2.4”項。

3.3 方法學(xué)的考察

3.3.1 精密度試驗 取供試品溶液10μL，連續(xù)進樣6次。結(jié)果，11個共有峰的RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

3.3.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液10μL，分別在0、2.5、5、7.5、10、24 h進樣。結(jié)果，11個共有峰的RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，按 “3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析。結(jié)果，11個共有峰的RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 指紋圖譜的建立與分析

3.4.1 樣品檢測 精密吸取各提取方法所得的供試品溶液10μL，進樣分析，指紋圖譜相似度軟件生成各提取法的共有模式，見圖1。

圖1 4種提取方法的共有模式

3.4.2 各提取工藝的指紋圖譜分析 各提取樣品中均檢出11個主要黃酮類指紋峰。為了對其相對提取率進行量化分析，分別對各供試液的實際峰面積按生藥質(zhì)量濃度0.1 g/mL進行折算，再以廣金錢草酶提法試液的特征峰面積為100%計，計算各提取工藝樣品供試液的峰面積相對轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。

表3 各提取工藝樣品供試液的峰面積相對轉(zhuǎn)移率

表3 各提取工藝樣品供試液的峰面積相對轉(zhuǎn)移率

峰號 水提法/% 醇提法/% 酶解法/% 半仿生法/% 1 74.12±11.78 87.24±24.08 100 64.98±20.32 2 63.44±15.86 71.59±17.06 100 57.00±13.08 3 70.37±16.38 80.58±19.46 100 63.04±11.50 4 58.99±9.86 77.41±23.01 100 55.00±14.91 5 70.12±19.13 86.45±22.01 100 57.34±15.04 6 37.86±6.71 80.15±20.69 100 28.54±9.79 7 47.01±10.85 89.47±26.29 100 34.25±9.31 8 40.72±5.75 82.54±19.11 100 42.87±10.12 9 66.33±10.81 79.95±25.56 100 67.14±16.52 10 76.96±8.74 88.18±24.00 100 78.01±18.85 11 40.70±6.22 99.48±14.96 100 48.35±10.35

3.5 同一批樣品不同提取方法的指紋圖譜 由圖2可知，在廣金錢草指紋圖譜的11個特征峰中，4種提取方法對提取效果都有不同程度的影響。以最強峰夏佛塔苷 （5號）而言，其占總峰面積的比例達25.15%，酶解法效果最好；次強峰 （9號）及其余各峰占總峰面積的比例達18.41%，醇提法效果比較好?？梢?，酶解法與醇提法的總黃酮提取率相當，但它們對HPLC指紋圖譜中各成分提取效果的影響還是有一定差異的，而半仿生法和水提法對11個特征峰的提取效果均不理想，尤以水提法最差。

圖2 同一批樣品4種提取方法的重疊圖

4 討論

酶解法與醇提法效果的差異不大，兩者都用乙醇進行提取，但前者用到了纖維素酶類來破壞廣金錢草的細胞壁，從而使提取率普遍提高。而半仿生法使用磷酸氫二鈉緩沖液，由于總黃酮成分的溶解性在酸性物質(zhì)中增大，故該方法的提取率略高于水提法。

根據(jù)廣金錢草總黃酮的測定結(jié)果來進行指紋圖譜的測定，發(fā)現(xiàn)4種方法的保留時間相當，但峰面積以及相對峰面積有明顯差異。總體來說，酶解法和醇提法的峰面積比較大，而且相近，而水提法和半仿生則比較小，兩者相差也不大。

綜合總黃酮提取率及廣金錢草指紋圖譜特征峰的提取效果，可知4種提取方法的效果依次為酶解法＞醇提法＞水提法＞半仿生法。

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R284.2

B

1001-1528（2015）11-2537-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.047

2014-07-08

廣東省科技計劃項目 （2009B060700012）

羅 蘭（1984—），女，碩士，工程師，從事藥物質(zhì)量分析。Tel：（020）87065055，E-mail：zirolland@126.com

*通信作者：張素中 （1969—），女，碩士，副教授，從事中藥質(zhì)量標準與指紋圖譜研究。Tel：（020）87065055，E-mail：Zhangsz620 @163.com