劉端勇， 徐 榮， 黃敏芳， 王 馨， 鄒 勇， 岳海洋， 趙海梅

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西南昌330025；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西南昌330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室，江西南昌330004）

香參丸對結(jié)腸炎大鼠小腸派伊爾結(jié)中T細胞亞群及IL-2、TGF-β表達的調(diào)節(jié)

劉端勇1， 徐 榮2， 黃敏芳2， 王 馨2， 鄒 勇2， 岳海洋2， 趙海梅3*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西南昌330025；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西南昌330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室，江西南昌330004）

目的 評價香參丸治療實驗性結(jié)腸炎療效并探討其作用機制。方法 三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）/乙醇法復(fù)制實驗性結(jié)腸炎，實驗動物隨機分成正常組、模型組、香參丸組及美沙拉嗪組，造模后灌胃給藥7 d，第8天處理，通過腸重指數(shù)、結(jié)腸長度、肉眼損傷評分評價其療效，同時分別采用流式細胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠小腸派伊爾結(jié)（PP結(jié)）中CD4+T、CD8+T淋巴細胞水平以及結(jié)腸組織白細胞介素-2（IL-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的量。結(jié)果 與模型組比較，香參丸組可明顯縮短結(jié)腸長度，降低結(jié)腸指數(shù)、肉眼下?lián)p傷評分、小腸PP結(jié)中CD4+T淋巴細胞水平以及結(jié)腸組織中IL-2和TGF-β表達水平（P＜0.05或P＜0.01），升高小腸PP結(jié)中CD8+T細胞水平，且同時降低CD4/CD8間比例。結(jié)論 香參丸有效治療潰瘍性結(jié)腸炎的機制可能是通過調(diào)節(jié)小腸PP結(jié)中T淋巴細胞亞群平衡，抑制IL-2和TGF-β表達水平來實現(xiàn)的。

香參丸；結(jié)腸炎；T細胞；IL-2；TGF-β

香參丸由苦參、木香組成，出自清代名醫(yī)葉天士，其中苦參苦寒，功長清熱燥濕，主要用于治療腸風(fēng)便血，對熱痢、血痢療效較好［1］，多與木香同用，木香辛開苦降，善行大腸之氣滯，為治療濕熱瀉痢之要藥，二者相配，協(xié)同起效，加甘草解毒并緩中健脾，現(xiàn)代常用于治療包括潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的各種瀉痢，但其作用機制不明。炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克隆病，目前普遍認(rèn)為IBD的產(chǎn)生主要來自于黏膜免疫、相關(guān)基因和環(huán)境因素，而效應(yīng)T細胞的活化是腸黏膜免疫及其后續(xù)炎癥的起點［2-3］。作為腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要組織，小腸派伊爾結(jié) （Peyer patch，PP結(jié)）主要由T淋巴細胞（以CD4+T淋巴細胞為主）和B淋巴細胞組成，這些細胞在抗原刺激及抗原提呈細胞的作用下活化，并高度表達相應(yīng)的受體，與對應(yīng)的配體結(jié)合后進入黏膜組織，釋放出炎性因子，介導(dǎo)炎性損傷［4］。為此，本研究采用TNBS/乙醇法復(fù)制實驗性結(jié)腸炎，并用香參丸干預(yù)治療，在觀察其療效同時并探討其對PP結(jié)中T淋巴細胞亞群平衡的影響。

1 實驗材料

1.1 動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g（由北京維通利華實驗動物有限公司提供），合格證號SCXK（京）2012-0001，隨機分為4組，即正常組、對照組、香參丸組、美沙拉嗪對照組 （陽性對照組），每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實驗。

1.2 主要藥物和試劑 香參丸由苦參 （批號1306056）、廣木香 （批號1308261）、甘草 （批號1308211）組成，中藥配方顆粒購自廣東一方制藥有限公司；美沙拉嗪腸溶片每片0.25 g（葵花藥業(yè)生產(chǎn)，批號130407）；TNBS（2，4，6-Trinitrobenzene sulfonic acid solution）分子量為293.17，購于美國SIGMA公司（批號2508-19-2）；FITC-anti-rat CD4+Ab（批號11-0040-82）、APC-anti-rat CD3+Ab（批號17-0030-82）、PE-anti-rat CD8+Ab（批號12-0084-82）購于美國eBioscience公司；IL-2（批號85-BMS634）和TGF-β（批號85-BMS623/3）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒亦購于美國eBioscience公司。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（Molecular Devices SpectraMax Plus 384）；低溫高速離心機（eppendorf Centrifuge 5430R）；流式細胞儀（美國BD FACSC CantoⅡ）

2 實驗方法

2.1 造模 參考文獻［5］，采用TNBS復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎

大鼠模型。造模前禁食12 h，除正常組外，所有大鼠用10%的水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉［6］后，按100 mg/kg TNBS計算，將TNBS溶入0.3 mL 50%乙醇配制TNBS乙醇復(fù)合溶液，用塑料軟管 （直徑約為2mm）將TNBS乙醇復(fù)合液注入距肛門約8 cm處，倒置大鼠15min，使藥液到達結(jié)腸，然后動物放回原籠自然蘇醒，正常組注入等容積的50%的乙醇溶液，即造模成功。

2.2 給藥 造模24 h后，開始給大鼠灌胃給藥，按體質(zhì)量換算，香參丸組給予香參丸2.5 g/kg，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪0.3 g/kg，空白組及模型組則給予等容積的生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 處理方法 給藥7 d后，脫頸椎處死動物，分離距肛門2 cm以上結(jié)腸組織，測量其長度，沿縱軸剪開結(jié)腸，清除內(nèi)容物，清洗干凈并吸去水分，稱取結(jié)腸質(zhì)量，將結(jié)腸于冰塊上展開，并將腸黏膜向上平鋪于冰塊上固定，觀察炎癥及潰瘍發(fā)生情況，按照肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷評分標(biāo)準(zhǔn)［7-8］進行結(jié)腸損傷評分。同時計算各組老鼠結(jié)腸指數(shù)，結(jié)腸指數(shù)=（結(jié)腸質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%，以考察結(jié)腸水腫等炎癥表現(xiàn)。

2.4 PP結(jié)分離及細胞懸液制備 給藥7 d后，脫椎處死動物后，剖腹剪取全小腸，分離PP結(jié)，置于5%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液中，300目不繡鋼網(wǎng)碾磨濾過，洗滌2次，3 000 r/min離心，5 min后，棄其上清，混勻定容于1×106后置4℃冰箱保存。

2.5 流式細胞術(shù)測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞水平取上述細胞懸液，分別加入0.5uL PE-anti-rat CD8+Ab，F(xiàn)ITC-anti-rat CD4+Ab，APC-anti-rat CD3+Ab等熒光標(biāo)記抗體，室溫下避光孵育30min后，加入1mLPBS洗滌，離心后棄上清，1%多聚甲醛的PBS固定后置4℃冰箱保存，待上機檢測。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)腸局部細胞因子水平 參照試劑盒的說明書檢測結(jié)腸組織勻漿中IL-2、TGF-β的量。待測上清液、標(biāo)準(zhǔn)品使用量均為50μL，波長450 nm下測定吸光度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，病理組織記分采用秩和檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 病理學(xué)觀察及結(jié)腸損傷評分 肉眼下可見模型組結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫，重度糜爛和多個潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，底部干凈，或可見少量淡黃色覆蓋物，邊緣充血水腫；腸重指數(shù)、結(jié)腸損傷評分明顯高于正常組，結(jié)腸長度明顯縮短 （P＜0.01）；治療組亦可見少量充血水腫和部分結(jié)腸可見輕度糜爛和潰瘍，潰瘍數(shù)目明顯減少并且充血水腫減輕，與模型組比較結(jié)腸指數(shù)、肉眼下結(jié)腸損傷評分明顯下降、結(jié)腸腫脹程度明顯減輕，結(jié)腸長度顯著延長（P＜0.01或P＜0.05）。提示香參丸治療組可明顯緩解結(jié)腸損傷局部充血水腫，減輕炎細胞浸潤程度，抑制潰瘍形成。結(jié)果見表1。

3.2 結(jié)腸組織中IL-2、TGF-β的表達 由表1可見，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-2、TGF-β表達水平明顯高于正常組（P＜0.05）；治療組與模型組比較，IL-2和TGF-β表達水平下降，且具有顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01）。

表1 療效評價及IL-2、TGF-β細胞因子的表達

表1 療效評價及IL-2、TGF-β細胞因子的表達

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分組 腸重指數(shù)/% 結(jié)腸長度/cm 肉眼下結(jié)腸損傷評分 IL-2/（pg.mL-1） TGF-β/（pg.m L-1）0.52±0.03 19.71±1.99 0.3±0.48 0.39±0.17 0.35±0.06模型組 1.02±0.43# 16.19±1.41## 5.89±2.81## 0.58±0.13# 0.45±0.03#香參丸組 0.65±0.08* 17.87±1.46* 2.22±1.39** 0.38±0.08** 0.39±0.05*美沙拉嗪組 0.71±0.12* 16.38±1.31 3.33±2.12* 0.35±0.11** 0.38±0.07正常組*

3.3 流式細胞術(shù)測定小腸PP結(jié)中CD4+、CD8+T淋巴細胞水平 與正常組比較可見，模型組CD4+T淋巴細胞水平顯著升高，CD8+T淋巴細胞水平顯著降低 （P＜0.05），CD4/CD8T的比值則顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，各治療組CD4+T淋巴細胞水平均顯著下降，而CD8+T淋巴細胞水平則顯著增加（P＜0.05），因此CD4/CD8T淋巴細胞的比值則明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 大鼠小腸PP結(jié)中CD4+、CD8+T淋巴細胞比較

表2 大鼠小腸PP結(jié)中CD4+、CD8+T淋巴細胞比較

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

CD4T/CD8正常組分組 CD4+T/% CD8+T/% 34.06±13.99 65.76±16.91 0.52±0.49模型組 57.60±16.56# 35.78±13.41# 1.61±0.56##香參丸組 32.73±1.62* 60.46±12.26* 0.54±0.43**美沙拉嗪組 37.97±14.01 63.35±17.51* 0.60±0.41**

4 討論

在本實驗中，模型組大鼠腸重指數(shù)以及肉眼下的結(jié)腸損傷評分均較正常組明顯升高，結(jié)腸長度明顯縮短，而采用香參丸灌胃治療后腸重指數(shù)及損傷評分均明顯降低，而結(jié)腸長度顯著延長，說明香參丸能有效緩解實驗性結(jié)腸炎的炎癥損傷程度和潰瘍形成。

腸黏膜免疫功能紊亂與UC發(fā)病密切相關(guān)，來自PP結(jié)的T淋巴細胞進入腸粘膜固有層失衡并活化，發(fā)揮效應(yīng)作用，因此觀察其T淋巴細胞平衡是監(jiān)控黏膜免疫狀態(tài)的重要手段［5］。本實驗結(jié)果表明，香參丸可明顯降低結(jié)腸炎大鼠小腸PP結(jié)中CD4+T淋巴細胞水平，升高CD8+T淋巴細胞水平，同時下調(diào)CD4/CD8比值，其原因可能是某些方面結(jié)腸局部致病性T淋巴細胞增多，免疫功能紊亂，且在此實驗中，炎性因子IL-2和TGF-β分泌增多，IL-2作為重要的促炎細胞因子，要由活化的Th1細胞或CD4+T細胞分

泌，與單核巨噬細胞、B細胞及T細胞表面的IL-2受體結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)自然殺傷 （NK）細胞生成并增強其活性；引起T細胞增殖、活化；促進細胞毒T細胞的殺傷作用［7-9］。因此，IL-2對于自身免疫調(diào)節(jié)具有重要意義。TGF-β是一種有效的免疫抑制因子，TGF-β水平的下降，將有利于淋巴細胞的激活，這將促進自身抗體和自身致敏T細胞的產(chǎn)生，誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎性免疫損傷［10-12］。TGF-β主要在結(jié)腸黏膜固有層的炎細胞如中性粒細胞、淋巴細胞及漿細胞中表達，TGF-β在正常結(jié)腸粘膜中的表達很弱，而在UC中表達明顯增強［13-14］。本研究表明模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-2和TGF-β的水平均明顯升高，經(jīng)過香參丸治療后，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中IL-2和TGF-β表達下降。此表明香參丸治療UC的機制之一可能是通過調(diào)節(jié)腸黏膜局部T淋巴細胞亞群平衡，抑制促炎因子IL-2和TGF-β的表達，從而抑制異常免疫反應(yīng)，減輕免疫損傷，促進潰瘍愈合。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2524-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.043

2014-11-10

國家自然科學(xué)基金項目 （81460679，81260595）；江西省自然科學(xué)基金項目 （20122BAB215046）

劉端勇 （1975—），男，博士，副教授，從事潰瘍性結(jié)腸炎與中藥免疫藥理研究。Tel：（0791）86588407，E-mail：liuduanyong@163.com

*通信作者：趙海梅 （1979—），女，博士，副教授，研究方向為潰瘍性結(jié)腸炎與中藥免疫藥理。Tel： （0791）86588407，E-mail：haimei79@163.com