常 鵬， 馬 巖， 胡雪劍， 李建雄

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州730030；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州450007；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅蘭州730030；4.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅蘭州730030）

黃芩苷對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

常 鵬1， 馬 巖2， 胡雪劍3， 李建雄4*

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州730030；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州450007；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅蘭州730030；4.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅蘭州730030）

目的 觀察黃芩苷對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及去甲腎上腺素能神經(jīng)活動(dòng)的影響。方法實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、模型組、黃芩苷組 （12.5 mg/kg）和尼莫地平組 （15 mg/kg），采用腹腔注射四氧嘧啶 （70 mg/kg）復(fù)制糖尿病模型，造模第4天起藥物處理，每天一次，持續(xù)至第56天。采用血糖儀檢測(cè)小鼠血糖，采用Morris水迷宮測(cè)試小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定小鼠大腦海馬區(qū)和額葉皮層區(qū)去甲腎上腺素 （NE）和間羥去甲腎上腺素 （NMN）的量。結(jié)果 造模后第28天和56天，與對(duì)照組相比，模型組潛伏期均明顯延長(zhǎng) （P＜0.01）；穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比均顯著性減少 （P＜0.01）。與模型組比較，黃芩苷組潛伏期縮短 （P＜0.05，P＜0.01），穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比明顯增加 （P＜0.05），且黃芩苷組和尼莫地平組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芩苷能夠有效抑制糖尿病小鼠大腦海馬區(qū)和額葉皮層區(qū)NE和NMN的量的降低 （P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 黃芩苷能夠有效改善四氧嘧啶致糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，其機(jī)制可能與其增加NE能神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)有關(guān)。

黃芩苷；糖尿病小鼠；學(xué)習(xí)記憶；去甲腎上腺素

黃芩苷是從唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georigi）中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要活性成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗感染、抗氧化和抗腦缺血致學(xué)習(xí)記憶功能損傷等多種藥理學(xué)作用［1-2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有降糖作用［3］，同時(shí)能夠有效防治糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿病腎病等慢性并發(fā)癥［4-7］。認(rèn)知功能損害是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能的障礙［8］。但黃芩苷對(duì)糖尿病致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響至今尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬觀察黃芩苷對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量24～28 g，由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK（甘）2009-0004。

1.2 藥物及試劑 黃芩苷 （純度≥98%，批號(hào)130309-2，上海純優(yōu)生物科技有限公司）；尼莫地平片 （20 mg，批號(hào)B131103015，四川科倫藥業(yè)股份有限公司），四氧嘧啶（美國(guó)sigma公司）；去甲腎上腺素 （NE）、間羥去甲腎上腺素酶聯(lián)免疫試劑盒 （NMN）（美國(guó)BD公司）。

1.3 儀器 Morris水迷宮（上海移數(shù)信息科技有限公司）；全波長(zhǎng)Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；ACCU-CHEK血糖儀（瑞士羅氏公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型建立及分組 參考文獻(xiàn)方法［9-10］，小鼠腹腔注射四氧嘧啶 （70 mg/kg）。于第3天腹腔取血測(cè)定禁食血糖，將空腹血糖濃度≥16 mmol/L的小鼠納入實(shí)驗(yàn)，分為模型組、黃芩苷組 （12.5 mg/kg）和尼莫地平組 （15 mg/kg），每組動(dòng)物均為12只。另設(shè)正常對(duì)照組，腹腔注射同體積的生理鹽水。第4天起黃芩苷組和尼莫地平組每天灌胃給藥一次，持續(xù)至第56天。模型組和正常對(duì)照組則灌服等體積生理鹽水。

1.4.2 Morris水迷宮測(cè)試 造模前5天對(duì)小鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，每只小鼠每天訓(xùn)練6次。訓(xùn)練時(shí)將小鼠面向池壁放入水中，使其尋找水中的平臺(tái) （平臺(tái)置于第Ⅰ象限，沒于水面下1 cm），找到平臺(tái)所用時(shí)間記為逃避潛伏期。設(shè)定尋找平臺(tái)的最大時(shí)限為90 s（即在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)者逃避潛伏期記為90 s）。移去平臺(tái)，選取原平臺(tái)正對(duì)象限 （第Ⅲ象限）的中點(diǎn)為入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，動(dòng)物自由游泳90 s，記錄90 s內(nèi)小鼠穿過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)和在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間。取最后6次測(cè)試結(jié)果的平均值為造模前成績(jī)。于造模后第4、28、56天分別進(jìn)行上述測(cè)試并記錄小鼠的逃避潛伏期、穿臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間。

1.4.3 神經(jīng)遞質(zhì)含有量檢測(cè) 待第56天測(cè)試結(jié)束后將小

鼠斷頭處死，于冰臺(tái)上快速分離大腦雙側(cè)海馬和額葉皮層，經(jīng)液氮冷凍后移至-80℃保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附法檢測(cè)NE及其代謝物NMN水平，操作均按試劑盒說明書完成。

表1 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

表1 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

組別 血糖值/（mmol.L1）第3天 第56天正常對(duì)照組9.1±1.2 9.2±1.5模型組 28.7±6.5## 26.5±6.8##黃芩苷組 29.1±10.2## 14.1±6.6#**

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響 如表1所示，小鼠注射四氧嘧啶后第3天模型組和黃芩苷組血糖值明顯升高，分別與正常對(duì)照組相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），模型組和黃芩苷組血糖值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第56天黃芩苷組血糖值與模型組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），但黃芩苷組血糖值仍然高于正常對(duì)照組 （P＜0.05）。

2.2 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果的影響 如表2所示，造模前水迷宮測(cè)試成績(jī)各組間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：與正常對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01造模后第4天，模型組、黃芩苷組和尼莫地平組潛伏期稍有延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比稍有降低，分別與正常對(duì)照組相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后第28天和56天，與正常對(duì)照組相比，模型組潛伏期均明顯延長(zhǎng) （P＜0.01）；穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比均顯著性減少 （P＜0.01）。與模型組比較，黃芩苷組和尼莫地平組潛伏期均縮短 （P＜0.05，P＜0.01），穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比均明顯增加 （P＜0.05），但黃芩苷組和尼莫地平組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果的影響

表2 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果的影響

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

指標(biāo) 組別 造模前 造模后第4天 第28天 第56天潛伏期/s 正常對(duì)照組23.2±2.9 23.1±3.6 22.7±1.1 23.4±2.2模型組 22.7±3.3 25.1±3.7 32.1±4.9## 34.5±4.6##黃芩苷組 22.9±4.1 24.6±4.4 29.3±5.1* 28.1±2.8**尼莫地平組 23.1±2.1 24.5±2.5 27.3±6.3** 26.6±7.1**穿臺(tái)次數(shù)/次 正常對(duì)照組 7.6±0.9 7.2±1.1 7.8±1.4 7.4±1.8模型組 7.5±1.3 6.4±1.7 4.3±0.8## 3.6±0.6##黃芩苷組 7.1±0.5 6.2±2.1 5.4±1.1* 5.5±0.8*尼莫地平組 7.5±1.2 6.5±0.7 5.9±1.0* 5.8±1.3*目標(biāo)象限停留時(shí)間比/% 正常對(duì)照組 38.1±6.3 39.3±9.4 38.8±9.6 37.8±7.3模型組 37.3±8.1 33.5±5.6 28.1±3.8## 26.8±6.9##黃芩苷組 39.6±7.5 34.4±7.4 31.1±8.5* 29.8±9.3*尼莫地平組 38.7±8.6 36.2±3.1 33.3±4.9* 34.1±5.5*

2.3 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠大腦NE和NMN水平的影響如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組海馬區(qū)和額葉皮層區(qū)NE和NMN的量均呈顯著性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。與模型組比較，黃芩苷組NE和NMN的量均有升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，P＜0.01）。

表3 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠大腦NE和NMN水平的影響

表3 黃芩苷對(duì)糖尿病小鼠大腦NE和NMN水平的影響

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別額葉皮層區(qū)NE/（μg.L-1） NMN/（ng.L-1） NE/（μg.L-1） NMN/（ng.L-1海馬區(qū)）96.2±22.5 241.4±96.1 132.7±24.6 387.8±48.3模型組 78.4±9.8## 102.5±26.4## 100.7±22.1## 201.6±55.4##黃芩苷組 90.1±10.6* 198.3±33.3** 117.5±18.9* 326.6±71.6正常對(duì)照組**

3 討論

四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型是研究糖尿病并發(fā)認(rèn)知障礙的常用模型。本研究參考文獻(xiàn)方法共取40只小鼠腹腔注射四氧嘧啶 （70 mg/kg），第3天測(cè)定禁食血糖發(fā)現(xiàn)其中36只空腹血糖濃度≥16 mmol/L，并將其納入實(shí)驗(yàn)，第56天測(cè)量發(fā)現(xiàn)，其高血糖依舊存在，表明本實(shí)驗(yàn)小鼠糖尿病模型是復(fù)制成功的。本研究造模后第4天Morris水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)各組動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶成績(jī)沒有明顯差異，第28天和56天測(cè)試發(fā)現(xiàn)四氧嘧啶處理組動(dòng)物水迷宮成績(jī)均呈顯著性下降，表明糖尿病學(xué)習(xí)記憶障礙模型成功建立。尼莫地平是目前臨床上證實(shí)對(duì)改善糖尿病認(rèn)知功能障礙患者的認(rèn)知功能最為有效的藥物［11］，因此，本研究選用尼莫地平作為陽(yáng)性對(duì)照。

糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害日益受到人們廣泛關(guān)注和研究，其中學(xué)習(xí)記憶障礙是糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的主要表現(xiàn)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷能夠縮短四

氧嘧啶致糖尿病小鼠水迷宮潛伏期增加穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間比，表明黃芩苷能夠有效緩解糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。之前關(guān)于黃芩苷改善多種模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能損傷的研究屢有報(bào)道，但改善糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙尚屬本文首次報(bào)道。一直以來，黃芩苷在糖尿病領(lǐng)域主要用于降糖［3］、防治糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿病腎病等慢性并發(fā)癥［4-7］。本研究結(jié)果無疑為其在糖尿病領(lǐng)域的應(yīng)用提供一種新的思路。

目前對(duì)糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，普遍認(rèn)為糖尿病認(rèn)知障礙是多環(huán)節(jié)、多因素的致病過程［14］。海馬和顳葉與記憶、學(xué)習(xí)密切相關(guān)，其超微結(jié)構(gòu)的損害可能為糖尿病認(rèn)知損害的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時(shí)，糖尿病引起的神經(jīng)遞質(zhì)異常也是糖尿病認(rèn)知障礙發(fā)生的一主要因素。高血糖造成腦神經(jīng)元損害，并影響一些神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，從而導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)破壞及腦功能的改變［15-16］。已有文獻(xiàn)顯示乙酰膽堿和多巴胺能神經(jīng)傳遞的降低可導(dǎo)致糖尿病認(rèn)知障礙［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四氧嘧啶致糖尿病小鼠大腦海馬區(qū)和額葉皮層區(qū)NE和NMN水平均呈顯著性降低，表明NE能神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)受到抑制，而黃芩苷能夠有效增加NE能神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)，因此本研究認(rèn)為，黃芩苷改善糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙除了其本身的降糖作用外，可能更與其增加NE能神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)有關(guān)。

總之，黃芩苷能夠有效改善四氧嘧啶致糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，其機(jī)制可能與其增加大腦海馬區(qū)和額葉皮層區(qū)NE能神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)有關(guān)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2521-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.042

2014-06-16

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（lzujbky-2013-46）

常 鵬（1991—），男，本科，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。Tel：15193130829，E-mail：lzuchangp@163.com

*通信作者：李建雄（1976—），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)病學(xué)。E-mail：ldeyljx@163.com