李以軍， 張文濤， 鄭作文*

（1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001）

壯藥依肝達對小鼠急性肝損傷的保護作用

李以軍1， 張文濤2， 鄭作文2*

（1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001）

目的 研究壯藥依肝達對四氯化碳（CCl4）和D-氨基半乳糖（D-GalN）所致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法 分別采用CCl4、D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠為模型，檢測用藥后小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）的量，并對肝組織進行病理檢查及損傷評分。結(jié)果 CCl4肝損傷實驗中，依肝達高、中劑量可降低急性肝損傷小鼠血清ALT的量 （P＜0.05），對AST無明顯作用，同時依肝達能減輕肝損傷小鼠肝組織胞漿凝聚及細胞壞死程度；D-GalN肝損傷實驗中，依肝達高、中、低劑量均能降低血清ALT水平 （P＜0.05），僅高劑量能降低急性肝損傷小鼠血清AST水平 （P＜0.05），同時依肝達能減輕小鼠肝組織胞漿凝聚程度。結(jié)論 壯藥依肝達對CCl4和D-GalN引起的急性肝損傷有保護作用。

依肝達；急性肝損傷；CCl4；D-GalN

壯藥依肝達主要由廣西壯族民間特色中草藥飯湯子（Viburnum Setigerum Hance）、田基黃（Hypericum japonicum Thumb）、三姐妹Rabdosia temifolia（D.Don）Hara等組成，具有清熱解毒，利膽退黃等功效，臨床用于治療急慢性肝炎，療效顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，飯湯子、田基黃、三姐妹均有顯著的保肝作用［1-3］，及抗乙肝病毒的作用［4-5］，故本實驗以壯藥依肝達為研究對象，進一步觀察其對急性肝損傷的保護作用。

1 材料

1.1 藥物提取與制備 依肝達：取三姐妹200 g、飯湯子300 g、田基黃150 g，混勻后用95%乙醇浸泡2 h后，水浴中回流提取2次，先后用10倍量與8倍量乙醇提取2 h，1 h后冷卻過濾，合并濾液濃縮，得黑棕色浸膏，每克浸膏相當(dāng)于13.6 g生藥。

1.2 試劑 聯(lián)苯雙酯 ［廣州星群 （藥業(yè)）股份有限公司，批號GF40085］；D-GalN（啟東市久豐工貿(mào)有限公司，批號20040610）；CCl4［中國醫(yī)藥 （集團）上海化學(xué)試劑公司，批號2010202］；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號20100210）。

1.3 儀器 離心機 （珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Lambda 35 UV（美國鉑金艾爾默公司）；電子天平 （德國賽多利斯公司，型號BP211D）；Motic生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，型號DMB-1223）。

1.4 動物 SPF級昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心 （生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2009-0002）。

2 方法

2.1 壯藥依肝達對CCl4所致急性肝損傷小鼠的影響 將SPF級昆明種小鼠按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、陽性組 （聯(lián)苯雙酯，600 mg/kg）、壯藥依肝達高、中、低劑量組 （17、8.5、4.25 g生藥/kg）。灌胃給藥，空白組和模型組給予純凈水，其余各組給予相應(yīng)的藥物，給藥容量均為20 mL/kg，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥后禁食不禁水，8 h后除空白組外其余各組腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液，容量為10 m L/kg，12 h后采血，測定血清中ALT、AST的量，取肝大葉用10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理改變，對肝組織行病理切片和病變評分［6-7］，評分指標(biāo)與方法見表1。

表1 肝組織病變程度評分方法

2.2 壯藥依肝達對D-GalN所致急性肝損傷小鼠的影響同 “2.1”項方法進行動物分組、給藥。末次給藥后禁食不禁水，8 h后除空白組外其余均腹腔注射D-GalN溶液，容量為10mL/kg，16 h采血，測定血清中ALT、AST水平，取肝大葉同 “2.1”項方法。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 壯藥依肝達對CCl4所致急性肝損傷小鼠的影響 由表2可知，依肝達高、中劑量組可明顯降低小鼠血清中ALT的水平，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）；依肝達對小鼠血清AST的升高無明顯影響 （P＞0.05）。由表3可知，正常組小鼠肝組織細胞結(jié)構(gòu)清晰、完整，未見炎性細胞浸潤；模型組肝細胞胞可見炎性細胞浸潤，胞漿凝聚、細胞壞死程度明顯；依肝達高、中劑量組能改善肝組織胞漿凝聚、細胞壞死的程度，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.01或P＜0.05）；低劑量組能改善肝細胞壞死程度，與模型組比較有顯著差異 （P＜0.05）。

表2 壯藥依肝達對CCI4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

表2 壯藥依肝達對CCI4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 劑量/（g.kg-1） ALT/（U.L-1） ）空白組 12 — 64.4±20.64** 104.2±25.31**12 4.25 495.4±109.97 264.4±66.49模型組 12 — 471.5±54.93 181.2±38.50陽性組 12 0.6 71.2±32.65** 148.0±29.31*依肝達高劑量組 12 17 385.2±100.57* 182.0±47.23依肝達中劑量組 11 8.5 378.8±129.78* 204.0±49.97依肝達低劑量組

表3 壯藥依肝達對CCI4所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

表3 壯藥依肝達對CCI4所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 水腫 氣變 脂變 胞凝 壞死空白組 1.05±1.36 0.32±0.78 1.27±1.33 0.05±0.15** 0.21±0.33**模型組 1.96±1.30 0.33±0.96 1.75±1.75 1.92±0.76 2.33±0.91陽性組 2.17±1.03 0.21±0.26 2.00±0.77 0.13±0.23** 0.58±0.51**依肝達高劑量組 0.96±0.75 0.17±0.33 2.29±0.72 0.42±0.36** 0.58±0.47**依肝達中劑量組 1.32±1.28 0.31±0.46 2.31±0.98 0.41±0.38** 1.05±0.52*依肝達低劑量組 0.67±0.54 0.08±0.19 1.42±1.61 0.50±0.56 1.13±0.71*

3.2 壯藥依肝達對D-GalN所致急性肝損傷小鼠的影響

由表4可知，依肝達高、中、低劑量組均可明顯降低肝損傷小鼠血清ALT的量，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）；依肝達高劑量組可明顯降低肝損傷小鼠血清AST的量，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）。由表5可知，正常組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)清晰、完整，未見明顯病理改變；模型組肝細胞可見炎性細胞浸潤，胞漿凝聚、細胞壞死較明顯；依肝達高、中、低劑量均能改善肝組織胞漿凝聚，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05）；依肝達高、中、低劑量對肝組織胞漿凝聚的改善作用，似以低劑量較優(yōu)，但高、中劑量與低劑量比較并無顯著性差異 （P＞0.05）。

表4 壯藥依肝達對D-GaIN所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

表4 壯藥依肝達對D-GaIN所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 劑量/（g.kg-1） ALT/（U.L-1） AST/（U.L-1）空白組 12 — 39.6±9.87** 51.1±11.16**114.6±47.28模型組 11 — 208.2±89.16 126.7±40.24陽性組 11 0.6 63.8±50.29** 90.5±31.21*依肝達高劑量組 11 17 134.0±73.13* 90.6±31.41*依肝達中劑量組 10 8.5 143.4±45.53* 119.9±40.63依肝達低劑量組 10 4.25 125.0±56.15*

表5 壯藥依肝達對D-Ga IN所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

表5 壯藥依肝達對D-Ga IN所致肝損傷小鼠肝組織病變的影響評分

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別 水腫 氣變 脂變 胞凝 壞死空白組 1.03±1.04 0±0 0.96±0.69 0.04±0.14* 0.71±0.39*模型組 1.30±1.10 0±0 0.71±0.99 0.92±1.10 1.38±0.86陽性組 0.88±1.04 0±0 0.46±0.58 0.08±0.19* 0.58±0.55*依肝達高劑量組 1.55±1.21 0±0 0.31±0.75 0.18±0.25* 1.23±0.96依肝達中劑量組 1.25±1.05 0±0 0.58±0.60 0.17±0.44* 1.11±0.76依肝達低劑量組 1.63±1.21 0±0 0.73±1.47 0.05±0.15*1.45±1.37

3 討論

肝損傷發(fā)生由許多因素引起，如病毒感染、頻繁接觸CCl4等化學(xué)性毒物、酗酒和濫用藥物［8-10］等。肝損傷引起肝細胞壞死、膽汁淤積、肝壞死、肝纖維化、肝硬化、肉芽腫性肝炎、脂肪肝、肝血管損害、膽管炎及肝良惡性腫瘤等一系列后果。當(dāng)肝細胞受損、細胞壞死或者凋亡時，可使細胞內(nèi)各種酶釋放，使血清中酶活性升高［11］，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）。

目前常用的實驗性肝損傷模型有CCl4性肝損傷，D-氨基半乳糖性肝損傷、免疫性肝損傷、醋氨酚性肝損傷、缺血性肝損傷等。其中CCl4性肝損傷模型是篩選保肝降酶藥物最常用模型，其優(yōu)點是成功率高、方法簡便、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、價格低廉。CCl4損傷肝組織的機制是CCl4經(jīng)肝微粒體細胞色素P450代謝激活后生成自由基三氯甲基（.CCl3），.CCl3可攻擊肝細胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化［12］，破壞肝細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整而使蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成代謝發(fā)生障礙。D-GalN肝損傷模型肝組織病理學(xué)特征與人類病毒性肝炎極為相似，是目前公認(rèn)的比較好的研究病毒性肝炎的發(fā)病機制及有效治療藥物的實驗動物模型，當(dāng)D-GalN進入體內(nèi)后，與磷酸尿苷（UDP）結(jié)合形成UDP-半乳糖胺，致使磷酸尿苷耗竭，從而使依賴其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等物質(zhì)合成受抑制，導(dǎo)致肝損傷。此外，D-GalN還可通過產(chǎn)生自由基引起脂質(zhì)過氧化，造成肝細胞損傷［13］；還可使肥大細胞脫顆粒釋放組胺，造成結(jié)腸水腫，使腸源性內(nèi)毒素吸收增加，引起內(nèi)毒素中毒損傷肝臟［14］。

依肝達是由壯藥三姐妹、飯湯子、田基黃組成的具有民族特色的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、利濕退黃、補益正氣和疏通龍路的功效。實驗結(jié)果表明，依肝達可以降低CCl4、D-GalN所致急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的水平，并能有效減輕肝組織病理損傷程度，對急性肝損傷小鼠有明顯保護作用，其作用機制可能是通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，促進肝細胞的核酸，蛋白質(zhì)、糖原的合成和能量的合成，促進肝臟循環(huán)，增強免疫能力等多環(huán)節(jié)、多靶點綜合作用而保護肝細胞防止肝損傷。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2518-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.041

2014-06-15

國家 “十一五”科技支撐計劃課題 （2006BAI06A17-03）

李以軍（1970—），男，主管藥師，主要從事中藥臨床藥學(xué)研究工作。Tel：13377136390，E-mail：fusuiliyijun@163.com

*通信作者：鄭作文 （1957—），男，碩士，教授，主要從事抗肝炎、抗腫瘤藥物研究。Tel：18977112788，E-mail：zzw_nn@163.com