趙行宇， 秦迎新， 沈 楠， 趙麗靜， 朱文赫， 陳默然， 張 巍

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

山核桃青皮萃取物抗內(nèi)源性H2O2致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

趙行宇， 秦迎新， 沈 楠， 趙麗靜， 朱文赫， 陳默然， 張 巍

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

目的 探討山核桃青皮萃取物對(duì)過(guò)氧化氫 （H2O2）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。方法 以葡萄糖氧化酶 （GOX）催化生成內(nèi)源性H2O2制作內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型；加入不同劑量的山核桃青皮萃取物，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；Annexin/PI雙標(biāo)記染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測(cè)Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量。結(jié)果 山核桃青皮萃取物改善了內(nèi)源性H2O2導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化；流式檢測(cè)結(jié)果顯示萃取物對(duì)細(xì)胞模型凋亡有明顯的抑制作用；電泳結(jié)果顯示Caspase-3和Bax表達(dá)量降低，Bcl-2表達(dá)增加，隨劑量增加，作用增加，具有劑量依賴性。結(jié)論 山核桃青皮萃取物對(duì)內(nèi)源性H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有抑制作用，其機(jī)制可能通過(guò)啟動(dòng)Caspase途徑實(shí)現(xiàn)。

山核桃；細(xì)胞凋亡；過(guò)氧化氫

血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病發(fā)生的重要因素，在針對(duì)血管內(nèi)皮損傷及保護(hù)作用進(jìn)行的研究中，關(guān)于中藥提取成分的作用及機(jī)制的研究，近年有所增加［1-6］。內(nèi)皮細(xì)胞損傷的原因中，氧化應(yīng)激受到一些研究者的關(guān)注，因?yàn)檠趸瘧?yīng)激不僅可以直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷，出現(xiàn)凋亡，而且多種凋亡刺激都伴隨有氧化應(yīng)激或者增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧集團(tuán)ROS水平［7-8］。研究也表明，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激可以抑制細(xì)胞凋亡，許多凋亡抑制劑都是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化的能力發(fā)揮作用，或者其本身就具有抗氧化活性。山核桃青皮是山核桃未成熟果實(shí)的青果皮，具有清熱解毒、抑菌鎮(zhèn)咳及抗癌等作用［7-10］。相關(guān)研究表明：山核桃青果皮萃取物在體外具有抗氧化活性［11-13］，但針對(duì)內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷后，萃取物對(duì)其的作用及相關(guān)機(jī)制未見報(bào)道。本研究以GOX催化葡萄糖產(chǎn)生內(nèi)源性H2O2制作內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察山核桃青皮萃取物干預(yù)后，氧化應(yīng)激損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡變化，并對(duì)這一作用的可能機(jī)制進(jìn)行探討，為后續(xù)的研究提供進(jìn)一步的證據(jù)。

1 材料方法

1.1 藥物萃取 山核桃采自吉林省林區(qū)，室溫下晾干。將核桃果實(shí)處理后得核桃青皮，用80%乙醇回流萃取30 min，于低溫回收溶劑，萃取物用水分散后用乙酸乙酯萃取，回收溶劑得萃取物0.324 kg，采用普魯士藍(lán)法測(cè)定總酚的量，極性部位總酚的量為18.2%。收集于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中蒸干，過(guò)濾除菌，萃取物稱重以DMSO溶解終質(zhì)量濃度為500μg/mL［14］。

1.2 試劑 胎牛血清由杭州四季青公司生產(chǎn)；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶（Trypsin）、過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于艾美捷科技有限公司，Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒、葡萄糖氧化酶（GOX）、Caspase-3、Bcl-2和Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 萃取物對(duì)葡萄糖氧化酶活性的影響 取24孔版，每培養(yǎng)孔加入高糖DMEM培養(yǎng)基，分5組，復(fù)孔數(shù)為5，置培養(yǎng)箱靜置1 h，各組分別加入50μL培養(yǎng)基、10 mU GOX、10mU GOX+25μg/mL萃取物、10 mU GOX+50 μg/m L萃取物、10 mU GOX+100μg/mL萃取物，在1、3、6、12 h按試劑盒的檢測(cè)方法測(cè)量過(guò)氧化氫產(chǎn)生量。

1.4 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞系 （EVC-304），購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由吉林醫(yī)藥學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為在5%CO2、濕度95%。每2天更換1次培養(yǎng)液，每周按1：3傳代。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，分成5組，正常對(duì)照組、10 mU GOX組、10 mU GOX+25μg/mL萃取物組、10 mU GOX+50μg/mL萃取物組、10 mU GOX+100μg/mL萃取物組，用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理同 “1.4”項(xiàng)，12 h后用胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，在15 000 r/m in條件下離心10min，棄去上清液；按試劑盒說(shuō)明書分別加入AnnexinⅤ-FITC和PI，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測(cè)Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)把上述分組培養(yǎng)的細(xì)胞用裂解液裂解后，收集提取細(xì)胞蛋

白，使用BCA法測(cè)蛋白的量。上樣量取60μg蛋白，設(shè)備為SDS-PAGE電泳儀，電轉(zhuǎn)凝膠上的蛋白至PVDF膜，兔抗人Caspase-3、Bcl-2及Bax抗體稀釋至1：1 000，4℃冰箱中孵育過(guò)夜，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h后，曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以正常對(duì)照組基準(zhǔn)，計(jì)算各個(gè)樣品相對(duì)于正常對(duì)照組蛋白量的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 13.0版本，不同劑量組數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行單因素方差分析和Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 萃取物對(duì)葡萄糖氧化酶活性的影響 葡萄糖氧化酶在不同質(zhì)量濃度萃取物條件下，產(chǎn)生過(guò)氧化氫的量見表1?？梢娕c正常對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度萃取物和GOX組反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫濃度明顯增加，差異顯著 （P＜0.01），同一時(shí)間點(diǎn)過(guò)氧化氫的量隨萃取物質(zhì)量濃度增加所有下降，但組間沒(méi)有顯著性差異，不同時(shí)間點(diǎn)過(guò)氧化氫的量沒(méi)有顯著性差異。

表1 不同萃取物質(zhì)量濃度對(duì)葡萄糖氧化酶催化產(chǎn)生H2O2的量的影響

表1 不同萃取物質(zhì)量濃度對(duì)葡萄糖氧化酶催化產(chǎn)生H2O2的量的影響

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01

21.5±4.3 20.9±5.1 20.3±5.3 19.4±6.2 10 mU GOX 53.3±5.2** 48.3±6.8** 50.3±4.9** 52.3±5.9**10 mU GOX+25μg/m L山核桃青皮萃取物 52.4±6.1** 49.3±4.9** 49.6±5.7** 49.5±6.3**10 mU GOX+50μg/m L山核桃青皮萃取物 50.5±5.7** 48.3±5.0** 48.7±5.8** 48.9±6.8**10 mUGOX+100μg/mL山核桃青皮萃取物 48.8±5.9** 47.1±5.6** 48.5±6.0** 50.1±6.6 1 h 3 h 6 h 12 h正常對(duì)照組組別H2O2/（μmol.L-1）**

2.2 萃取物對(duì)EVC-304細(xì)胞形態(tài)的影響 正常對(duì)照組（圖1A）細(xì)胞生長(zhǎng)良好，貼壁生長(zhǎng)，呈多角形或長(zhǎng)梭形，呈鵝卵石樣鋪滿底層。而10 mU GOX組（圖1B）細(xì)胞在作用24 h后，細(xì)胞胞體變小、間隙增大，細(xì)胞變圓收縮，胞漿透明，失去細(xì)胞間連接，大多數(shù)細(xì)胞懸浮脫落；不同質(zhì)量濃度萃取物與10mU GOX混合培養(yǎng)后（圖1C～圖1E）細(xì)胞形態(tài)與狀態(tài)與正常對(duì)照相似，但隨劑量增加，細(xì)胞形態(tài)改善越好，具有劑量依賴性。

圖1 各組EVC-304細(xì)胞形態(tài)（×400）

2.3 萃取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 各組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡百分比見表2，由表可見，正常對(duì)照組的凋亡最少，10 mU GOX組凋亡最多，與正常對(duì)照組比較，其它各組差異顯著 （P＜0.01）；與10 mU GOX組比，其它各組差異顯著 （P＜0.05，P＜0.01）；不同給藥劑量組凋亡量介于正常對(duì)照組與10 mU GOX組之間，隨劑量增加，凋亡增加。具有劑量依賴性。

表2 各組對(duì)EVC-304細(xì)胞凋亡的影響

表2 各組對(duì)EVC-304細(xì)胞凋亡的影響

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與10 mU GOX組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 細(xì)胞凋亡率/%正常對(duì)照組 3.15±1.07##10 mUGOX組 46.31±4.85**10 mUGOX+25μg/mL山核桃青皮萃取物組 9.48±3.17**##10 mUGOX+50μg/mL山核桃青皮萃取物組 18.59±5.24**##10 mU GOX+100μg/m L山核桃青皮萃取物組 32.65±6.13**#

2.4 萃取物對(duì)Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 各組內(nèi)皮細(xì)胞的Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)情況見圖2和表3。結(jié)果可知，正常對(duì)照組與GOX組表達(dá)量存在明顯差異 （P＜0.01），與正常對(duì)照組相比，不同劑量萃取物導(dǎo)致Caspase-3蛋白表達(dá)升高，25μg/mL組差異顯著（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)降低，25μg/mL和50μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著 （P＜0.01，P＜0.05）；Bax蛋白表達(dá)升高，25μg/mL和50μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著（P＜0.01，P＜0.05）。與GOX組相比，使用萃取物后，Caspase-3蛋白表達(dá)下降，不同劑量給藥組差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；Bcl-2蛋白表達(dá)上升，50μg/mL和100μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著 （P＜0.05，P＜0.01）；Bax蛋白表達(dá)下降，100μg/mL山核桃青皮萃取物組差異顯著 （P＜0.01）。隨萃取物劑量增加，變化越明顯，具有劑量依賴特性。

圖2 萃取物對(duì)Caspase-3、BcI-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

表3 各組Caspase-3及BcI-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量

表3 各組Caspase-3及BcI-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量

注：與10 mU GOX組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

Caspase-3 Bcl-2 Bax正常對(duì)照組10 mU GOX組組別1** 2.31±0.98##1** 0.31±0.16##1** 3.35±1.05##10 mUGOX+25μg/mL山核桃青皮萃取物組 2.01±0.87*# 0.43±0.17## 2.83±0.93##10 mU GOX+50μg/m L山核桃青皮萃取物組 1.65±0.74** 0.55±0.17*# 2.11±0.89#10 mU GOX+100μg/m L山核桃青皮萃取物組 1.29±0.34** 0.65±0.16** 1.75±0.90**

3 討論

在體內(nèi)正常水平的H2O2在具有一定意義，如參與免疫和信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程［15-18］。但在一些異常狀態(tài)時(shí)，H2O2產(chǎn)生過(guò)多，就會(huì)產(chǎn)生破壞作用，損傷人體正常的組織細(xì)胞，損傷核酸結(jié)構(gòu)，誘發(fā)突變及細(xì)胞凋亡等改變，進(jìn)而引發(fā)老年癡呆癥、心臟病、帕金森病和腫瘤等多種疾?。?9-22］。在我們的研究中，針對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞首次采用了酶催化，緩慢而持久的產(chǎn)生內(nèi)源性H2O2誘導(dǎo)損傷，避免了外源性H2O2損傷嚴(yán)重且迅速消失、無(wú)法模擬體內(nèi)H2O2損傷的缺點(diǎn)。從不同質(zhì)量濃度的萃取物與GOX在高糖培養(yǎng)液中生成過(guò)氧化氫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，過(guò)氧化氫的量比較穩(wěn)定，至于高劑量萃取物質(zhì)量濃度下過(guò)氧化氫的量的下降趨勢(shì)，可能是由于酚類物質(zhì)自身的抗氧化作用導(dǎo)致的過(guò)氧化氫分解造成的，但由于對(duì)過(guò)氧化氫的量的影響尚未達(dá)到顯著的差異，該損傷模型可以用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：加入GOX后，細(xì)胞形態(tài)上改變明顯，流式結(jié)果也顯示細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡，說(shuō)明，加入GOX后，可以有效的模擬內(nèi)源性H2O2損傷造成的凋亡。使用不同質(zhì)量濃度的萃取物進(jìn)行干預(yù)的結(jié)果表明，核桃青皮萃取物對(duì)內(nèi)源性H2O2損傷導(dǎo)致的凋亡作用具有抑制作用，說(shuō)明萃取物對(duì)由內(nèi)源性H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且在一定劑量范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度越高抑制作用也越強(qiáng)，說(shuō)明這種保護(hù)作用有一定的劑量依賴特點(diǎn)。同時(shí)我們也觀察到萃取物干預(yù)后，Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)下降、Bcl-2蛋白表達(dá)增加，這說(shuō)明，萃取物的保護(hù)作用與對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的調(diào)節(jié)以及Caspase凋亡通路有關(guān)，而且這種變化也具有劑量依賴的特點(diǎn)，說(shuō)明萃取物可以影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡通路的調(diào)控。Bax蛋白在對(duì)Caspase凋亡通路的影響上，表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡的發(fā)生，其表達(dá)的增加會(huì)增加Bax蛋白的同源結(jié)合，激活Caspase凋亡通路，引發(fā)凋亡。而Bcl-2蛋白與Bax競(jìng)爭(zhēng)異源結(jié)合，抑制Bax蛋白對(duì)Caspase凋亡通路的激活，發(fā)揮對(duì)H2O2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中Caspase-3蛋白表達(dá)下降的結(jié)果也說(shuō)明，除了上述的抑制凋亡作用外，其還可以通過(guò)下調(diào)Caspase凋亡通路的蛋白，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。但這兩種作用之間有無(wú)相互影響，以及是否還有其他的原因，仍然需要進(jìn)一步的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2511-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.039

2014-10-15

吉林省科技廳科技發(fā)展項(xiàng)目 （20130101157JC）；吉林省教育廳 “十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 （2012-334）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 （2014-363）

趙行宇（1970—），男，碩士，副教授，研究方向?yàn)榭寡趸瘧?yīng)激中藥篩選。Tel：13844239332，E-mail：jlmmczw@163.com