賀 克， 劉 姣， 劉麗華， 李彩霞， 王 康， 申曉日

（1.石家莊市第四醫(yī)院，河北石家莊050011；2.河北中醫(yī)學(xué)院實驗中心，河北石家莊050200）

白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

賀 克1， 劉 姣2*， 劉麗華1， 李彩霞1， 王 康2， 申曉日2

（1.石家莊市第四醫(yī)院，河北石家莊050011；2.河北中醫(yī)學(xué)院實驗中心，河北石家莊050200）

目的 觀察白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響。方法 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射鏈脲佐菌素 （STZ）的方法建立2型糖尿病胰島素抵抗模型。設(shè)空白組、模型組、陽性藥二甲雙胍組、白背三七總黃酮高劑量組、中劑量組及低劑量組，給藥6周后測各組大鼠糖耐量 （GTT），空腹血糖 （FPG）、糖化血紅蛋白 （GHb）和血清胰島素（FINS）水平，計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），RT-PCR法檢測肝細(xì)胞膜胰島素受體 （InsR）mRNA表達(dá)。結(jié)果 高劑量及中劑量白背三七總黃酮組大鼠的糖耐量得到顯著改善 （P＜0.01），F(xiàn)PG、GHb、FINS及HOMA-IR水平顯著減少（P＜0.01），ISI水平顯著上升（P＜0.01），肝細(xì)胞膜InsR mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng) （P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 白背三七總黃酮能夠改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與上調(diào)InsR mRNA的表達(dá)有關(guān)。

白背三七總黃酮；2型糖尿??；胰島素抵抗；胰島素受體

白背三七Gynura divaricata（L.）DC.又名白（百）子菜，來源于菊科菊三七屬植物白子菜，根、莖、葉均可入藥，其味甘、淡，性寒，具有清熱涼血、散痞消腫之功效，主要用于支氣管炎、肺結(jié)核、跌打損傷、外傷出血等［1-2］。近年來，民間有用白背三七治療糖尿病、高血脂及高血壓等病的情況，文獻(xiàn)中也可見白背三七降糖作用的相關(guān)報道［3-5］。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，白背三七提取物對胰島素抵抗 （IR）模型大鼠的空腹血糖 （FPG）、糖耐量（GTT）、糖化血紅蛋白 （GHb）及血清胰島素水平（FINS）均有降低作用?；瘜W(xué)研究顯示，白背三七中主要含有黃酮、多糖等，其中黃酮類為降血糖的主要活性成分［4，6-7］。為進(jìn)一步探討白背三七總黃酮對2型糖尿病IR的改善作用，并明確其作用機(jī)理，本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量注射鏈脲佐菌素的方法復(fù)制2型糖尿病大鼠

模型，以白背三七總黃酮治療后，觀察大鼠FPG、GTT、GHb、FINS水平以及肝臟胰島素受體（InsR）mRNA表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購自河北省實驗動物中心 （許可證號SYXK冀2006-0047），動物合格證號1305032。

1.1.2 藥物 取白背三七，粉碎后以乙醇回流提取，提取液濃縮后上大孔樹脂柱，以不同濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后即得白背三七總黃酮 （總黃酮的量為51.32%），由河北中醫(yī)學(xué)院實驗中心制備。鹽酸二甲雙胍片 （0.25 g/片，深圳市中聯(lián)制藥有限公司）。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司）；強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖試紙 （強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司）；糖化血紅蛋白試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；RTPCR試劑盒（寶生物工程有限公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）。

1.1.4 儀器 強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀 （強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司）；756MC型紫外-可見分光光度計 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；PE9600型PCR擴(kuò)增儀（美國PE公司）；電泳儀及電泳槽 （北京六一儀器廠）；MDF-382E超低溫保存箱（日本SANYO公司）；1-15K高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 高脂飼料的制備 高脂飼料的配方為：66.5%普通飼料、20%糖粉、10%豬油、2.5%膽固醇加1%膽酸鈉，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心加工。

1.2.2 動物模型制備 60只SD大鼠，隨機(jī)分為空白組10只和造模組50只，分別給予常規(guī)飼料和高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，造模組大鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg，空白組腹腔注射相同體積的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。2 d后，于鼠尾采血測量血糖值，空腹血糖＞10.0 mmol/L，即得2型糖尿病大鼠。

1.2.3 分組與給藥 選取造模成功的大鼠50只，按空腹血糖值隨機(jī)分組，分為2型糖尿病模型組、白背三七總黃酮高劑量組（120mg/kg）、中劑量組（60mg/kg）、低劑量組（30 mg/kg）及二甲雙胍陽性對照組（100 mg/kg）5組，每組10只。各給藥組大鼠按照每次1mL/100 g體質(zhì)量的容量灌胃給藥，空白組及模型組大鼠給等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)6周。

1.2.4 標(biāo)本采集 實驗結(jié)束后，大鼠禁食12 h，腹主動脈取血，離心分離血清。迅速取部分肝組織，于液氮中保存。

1.2.5 指標(biāo)檢測

1.2.5.1 葡萄糖耐量試驗（GTT） 大鼠禁食12 h，灌胃2 g/kg葡萄糖，0、30、120min分別尾部取血，用血糖儀測定血糖值，并計算血糖-時間曲線下面積 （AUC）以表示糖耐量。0.25×（0 h血糖值+4×0.5 h血糖值 +3×2 h血糖值）1.2.5.2 測定空腹血糖 （FPG）、糖化血紅蛋白 （GHb）及空腹血清胰島素水平 （FINS），計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） 分光光度法測定大鼠FPG及GHb水平，放免法測定空腹FINS水平，并計算ISI和HOMA-IR。ISI=IN［1/（FPG×FINS）］，HOMAIR=（FRG×FINS）/22.5。

1.2.5.3 RT-PCR測定肝細(xì)胞膜胰島素受體（InsR）mRNA表達(dá)水平 將大鼠肝臟組織加入Trizol溶液后研磨，分離并保存總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。InsR擴(kuò)增條件：94℃3 min；94℃40 s，52℃50 s，72℃90 s，進(jìn)行30個循環(huán)；然后72℃10 min。GAPDH擴(kuò)增條件：55℃50 s，其余條件與InsR擴(kuò)增相同。用凝膠緩沖液配制瓊脂糖凝膠，進(jìn)行DNA樣品電泳，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，通過比較二者的吸光度積分來表示InsR mRNA表達(dá)量。

PCR引物序列：正向引物5′-CAAGAAGTTTGTGCACCGGG-3′，反向引物5′-GTCCTTGAGCAGGTTGACGA-3′，預(yù)擴(kuò)增片段為421 bp；GAPDH正向引物5′-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3′，反向引物5′-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′，擴(kuò)增片段為594 bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗及單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對2型糖尿病大鼠血糖 （BG）及糖耐量 （GTT）的影響 由表1可知，模型組0、0.5、2 h的BG及GTT均較空白組顯著升高 （P＜0.01）。給藥6周后，與模型組相比，陽性藥二甲雙胍組0、0.5、2 h三個時間點的BG及GTT均顯著降低 （P＜0.01）；白背三七總黃酮高劑量組各時間點BG及GTT值均顯著降低 （P＜0.01）；白背三七總黃酮中劑量組0、2 h的BG及GTT值顯著降低（P＜0.01），0.5 h的BG值也明顯降低 （P＜0.05）；白背三七總黃酮低劑量組0 h的BG值出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05），但0.5、2 h的BG及GTT與模型組相比則無顯著性差異 （P＞0.05）。

2.2 對2型糖尿病大鼠空腹血糖 （FPG）及糖化血紅蛋白（GHb）值的影響 由表2可知，與空白組相比，模型組大鼠FPG及GHb值顯著升高 （P＜0.01）。給藥6周后，二甲雙胍陽性對照組大鼠FPG及GHb水平較模型組均出現(xiàn)顯著下降 （P＜0.01）；高劑量的白背三七總黃酮能使大鼠的FPG、GHb水平較模型組出現(xiàn)顯著下降 （P＜0.01）；白背三七總黃酮中劑量組FPG值顯著降低（P＜0.01），GHb值也明顯降低 （P＜0.05）；白背三七總黃酮低劑量組FPG值明顯降低 （P＜0.05），而GHb值與模型組比較則無顯著性差異 （P＞0.05）。注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表1 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠BG及GTT的影響

表1 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠BG及GTT的影響

組別 BG/（mmol.L-1）0 h 0.5 h 2 h GTT/（mmol.h-1.L-1）空白組 5.04±0.23** 5.95±0.65** 4.78±0.26** 10.79±0.81**18.15±1.86 14.35±1.29 32.40±3.04模型組 16.58±2.99 20.05±3.14 16.68±2.80 36.70±5.78二甲雙胍組 5.94±0.78** 6.92±0.58** 5.80±0.71** 12.76±1.02**白背三七總黃酮高劑量組 7.99±1.82** 10.01±2.96** 8.30±2.36** 18.24±5.09**白背三七總黃酮中劑量組 12.45±1.82** 17.02±2.38* 13.07±1.63** 29.93±3.56**白背三七總黃酮低劑量組 13.97±1.22*

表2 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FPG和GHb的影響

表2 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FPG和GHb的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 FPG/（mmol.L-1） GHb/（g.m L-1）空白組 4.99±0.38** 14.66±3.31**模型組 16.98±3.00 25.86±3.70二甲雙胍組 5.80±0.69** 15.77±2.55**白背三七總黃酮高劑量組 8.13±1.74** 17.34±2.71**白背三七總黃酮中劑量組 12.17±1.52** 22.33±2.38*白背三七總黃酮低劑量組 14.18±1.29*24.72±2.20

2.3 對2型糖尿病大鼠空腹血清胰島素水平 （FINS）、胰島素敏感指數(shù)（ISI）及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的影響 由表3可知，與空白組相比，模型組大鼠的FINS及HOMA-IR水平出現(xiàn)顯著提高（P＜0.01），ISI水平則顯著下降 （P＜0.01）。給藥6周后，陽性藥二甲雙胍、高劑量及中劑量的白背三七總黃酮能使2型糖尿病大鼠的FINS及HOMA-IR水平較模型組顯著下降（P＜0.01），ISI水平則出現(xiàn)顯著上升（P＜0.01）；白背三七低劑量組HOMA-IR與模型組比較出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05），而FINS及ISI則無顯著性差異 （P＞0.05）。

表3 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FINS，ISI以及HOMA-IR的影響

表3 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠FINS，ISI以及HOMA-IR的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 FINS/（m IU.L-1）ISI HOMA-IR空白組 38.17±3.14**-5.26±0.11** 8.56±0.94**模型組 62.08±6.18 -6.92±0.18 45.51±7.79二甲雙胍組 44.86±6.80**-5.57±0.18**11.78±1.98**白背三七總黃酮高劑量組41.38±5.44**-5.78±0.22**14.55±3.03**白背三七總黃酮中劑量組51.92±4.49**-6.46±0.21**28.88±5.80**白背三七總黃酮低劑量組59.83±5.12 -6.72±0.12 37.14±4.65*

2.4 對2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜胰島素受體 （InsR）mRNA表達(dá)的影響 由表4、圖1可知，與空白組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞膜的InsR mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.01）。給藥6周后，陽性藥二甲雙胍及高劑量的白背三七總黃酮均能使大鼠的InsRmRNA表達(dá)較模型組出現(xiàn)顯著上調(diào) （P＜0.01），中劑量白背三七總黃酮也能明顯上調(diào)InsR mRNA表達(dá) （P＜0.05），低劑量組則無顯著性差異 （P＞0.05）。

表4 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜InsR m RNA表達(dá)的影響

表4 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜InsR m RNA表達(dá)的影響

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表達(dá)空白組 2 370.50±178.90組別 InsRmRNA ** 1 142.00±164.05模型組 933.00±80.61二甲雙胍組 2 228.50±68.59**白背三七總黃酮高劑量組 1 678.00±158.39**白背三七總黃酮中劑量組 1 297.00±138.59*白背三七總黃酮低劑量組

圖1 白背三七總黃酮對2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜InsR m RNA表達(dá)的影響

3 結(jié)論

胰島素是體內(nèi)唯一能夠降低血糖的激素，機(jī)體分泌胰島素后，當(dāng)其與胰島素受體相結(jié)合，通過去磷酸化和磷酸化，激活多種激酶，引起多級聯(lián)效應(yīng)，實現(xiàn)體內(nèi)血糖的調(diào)節(jié)，以適應(yīng)外界環(huán)境的不斷變化，維持血糖的穩(wěn)定［8-9］。如果此過程中的某些環(huán)節(jié)發(fā)生異常，則會影響到胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起糖代謝異常。因此在1942年，Himsworth將糖尿病分為胰島素敏感型和不敏感型兩類，并于1979年在糖尿病分類中確定了胰島素抵抗 （IR）的概念［10］。IR是指機(jī)體在促進(jìn)葡萄糖攝取和利用方面受損，即一定量的胰島素產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于預(yù)期的正常水平［11-13］。研究顯示，胰島素抵抗的發(fā)生多與胰島素受體和受體后的缺陷有關(guān)。IR不僅是2型糖尿病的主要病機(jī)，還是引起心血管疾病、血脂代謝紊亂等多種疾病的重要危險因素［14］。而改善IR是治療上述疾病的關(guān)鍵。

糖尿病胰島素抵抗患者，因其胰島素生物效應(yīng)減低，可造成葡萄糖在脂肪、肌肉及肝臟組織的利用量減少，加劇肝糖原分解為葡萄糖，出現(xiàn)高血糖，因而出現(xiàn)血糖高于

正?；蛱悄土慨惓５默F(xiàn)象［15］。但空腹血糖較容易受到進(jìn)食和糖代謝等因素的影響，因此在2010年，美國ADA糖尿病協(xié)會就將糖化血紅蛋白 （GHb）作為診斷糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)之一［16］。GHb是葡萄糖與血紅蛋白的β鍵N末端纈氨酸殘基非酶化結(jié)合而成，這是一個不可逆的過程，因此GHb的量與血糖濃度成正比。因GHb不易分解，相當(dāng)穩(wěn)定，可以可靠的反映出近2、3個月內(nèi)的平均血糖值，且不易受到飲食、運(yùn)動等因素的干擾，可以看作是確診糖尿病的一項有重要意義的標(biāo)記物［16］。

本研究通過高糖高脂飼料喂飼加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病胰島素抵抗大鼠模型。鏈脲佐菌素為胰島β細(xì)胞毒劑，可引起胰島素缺乏。如單純注射鏈脲佐菌素，誘導(dǎo)的模型較類似于人類Ⅰ型糖尿病。且大劑量注射鏈脲菌素較易損傷肝臟、骨骼肌等靶組織，并對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響［17-18］。本研究前期以高糖高脂飼料喂飼大鼠4周，引起大鼠高脂血癥、高胰島素血癥等，再小劑量注射鏈脲佐菌素，從而導(dǎo)致糖尿病胰島素抵抗。造模后，可見模型組大鼠FPG、GTT、GHb、FINS、HOMA-IR升高，ISI降低，表明其已經(jīng)發(fā)生了胰島素抵抗。

白背三七地上部分在民間常用于糖尿病、高血脂及高血壓的輔助治療，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也已經(jīng)證實了其降血糖及降血脂作用，并確定其主要藥理活性成分為總黃酮類［3-6］。為了進(jìn)一步觀察白背三七總黃酮對糖尿病胰島素抵抗的影響，并探討其作用機(jī)制，本研究復(fù)制糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，以白背三七總黃酮進(jìn)行治療。治療后可見，大鼠FPG、GTT、GHb、FINS、HOMA-IR顯著降低，ISI顯著升高，且InsR mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，白背三七總黃酮能夠降低血糖，改善糖耐量，且對IR大鼠的高胰島素血癥也有改善作用。而白背三七總黃酮對糖尿病IR大鼠的改善性作用，與促進(jìn)肝細(xì)胞膜InsR mRNA表達(dá)增強(qiáng)，調(diào)節(jié)受體環(huán)節(jié)，增強(qiáng)2型糖尿病IR大鼠胰島素的生物效應(yīng)，抑制胰島素的過度分泌有關(guān)。

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R285.5

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1001-1528（2015）11-2501-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.036

2014-11-24

河北省科技支撐計劃項目 （11231005D）

賀 克（1977—），女，碩士，副主任藥師，從事中藥學(xué)研究工作。Tel：18633039389，E-mail：hkwkc@sina.com

*通信作者：劉 姣 （1978—），女，碩士，副教授，從事中藥藥理學(xué)教學(xué)及研究工作。Tel：13483127682，E-mail：fairypc_lj@ 163.com