張洪超

（黑龍江省醫(yī)院普外一科，黑龍江 哈爾濱 150300）

·臨床論著·

樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞對(duì)人體影響的實(shí)驗(yàn)研究

張洪超

（黑龍江省醫(yī)院普外一科，黑龍江 哈爾濱 150300）

目的探究樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（DC-CIK）細(xì)胞輸注對(duì)胰腺腫瘤患者的影響。方法對(duì)30例經(jīng)病理證實(shí)的胰腺腫瘤患者輸注自體DC-CIK細(xì)胞，每例均在輸注前、后抽取血液，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量T細(xì)胞亞群和CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的改變；ELISA法測(cè)量IFN-γ和IL-4數(shù)值的變化。結(jié)果患者輸注后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+T細(xì)胞含量增加，CD4+/CD8+含量增加，CD8+T細(xì)胞含量減少（P＜0.01）；CD4+CD25+CD127lowTreg減少（P＜0.01）；Th1細(xì)胞因子IFN-γ含量較輸注前增加，而Th2細(xì)胞因子IL-4含量減少（P＜0.01）。結(jié)論DC-CIK細(xì)胞輸注可以改善胰腺腫瘤患者的免疫機(jī)能，加強(qiáng)人體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，是治療胰腺腫瘤患者的一個(gè)方法。

樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；胰腺腫瘤；T淋巴細(xì)胞

生物治療已經(jīng)成為一個(gè)新的常規(guī)抗腫瘤療法，也為晚期不適合手術(shù)或者承受不住其他療法的患者開辟了一個(gè)新的治療途徑。胰腺腫瘤是常見的消化系惡性腫瘤。初期無明顯癥狀，當(dāng)出現(xiàn)黃疸或疼痛時(shí)為時(shí)已晚，或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或腫瘤已固定不能切除，治療困難。即使可以手術(shù)治療，因該手術(shù)損傷大且易復(fù)發(fā)，術(shù)后需配合化療，患者機(jī)體承受打擊大，免疫力明顯降低，這時(shí)，生物治療是這一患者可以采取的

有效治療措施，甚至首選治療措施。樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（dendritic cells-cytokine induced killer cells，DC-CIK）是近些年發(fā)展起來的新型高效的生物活性細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外已廣泛開展治療癌癥方面的科研和臨床治療[1-2]。現(xiàn)在報(bào)道證實(shí)，經(jīng)過手術(shù)或化療的患者免疫機(jī)能下降，給予DC-CIK細(xì)胞治療可以讓患者在治療腫瘤的同時(shí)，免疫機(jī)能得到提高，在提高繼續(xù)接受治療的能力和提高患者生存質(zhì)量方面都有重要意義[3]。不過，在胰腺腫瘤治療方面的文獻(xiàn)不多，本文通過免疫指標(biāo)的測(cè)量，對(duì)給患者輸注DC-CIK細(xì)胞前后指標(biāo)的量化對(duì)比，觀察DCCIK細(xì)胞生物治療對(duì)胰腺腫瘤患者的作用。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取普外科2010年5月-2012年12月收治的胰腺腫瘤患者共30例。其中男18例，女12例，年齡40～70歲。全部患者都是胰腺腫瘤確診病例，全部病例按國(guó)際抗腫瘤聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)給予分期（TNM分期），Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ期12名，Ⅳ期9例。全部患者卡氏評(píng)分≥60分，心、腎、肝臟功能均正常。所有均是根治手術(shù)后患者，術(shù)后給予采自自身的DC-CIK細(xì)胞輸注，全部患者在輸注DC-CIK細(xì)胞前，醫(yī)生都與家屬及患者本人進(jìn)行溝通，本人及家屬均表示同意，并簽字。

1.2主要試劑

rhINF-γ購自上?？寺∩锛夹g(shù)公司，抗人CD3單克隆抗體購自eBioscience公司，人rhIL-4、rhIL-2、rhIL-1a、rhGM-CSF購自PeproTech公司，F(xiàn)icoll液、人無血清培養(yǎng)基AIM-V購自美國(guó)GIB-CO公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記鼠抗人CD3、CD127單克隆抗體、PE標(biāo)記鼠抗人CD8、CD4、CD56單克隆抗體、PE-Cy5標(biāo)記鼠抗人CD25單克隆抗體和同型對(duì)照IgGα1購自美國(guó)BD公司，人IFN-γ、IL-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自晶美生物工程有限公司，rhGMCSF（注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子）購自廈門特寶生物工程股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樹突狀細(xì)胞的制備所有操作嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)程序。采集患者外周血2×109～3×109個(gè)單個(gè)核細(xì)胞及血漿80 ml（Kabi Fresenius，German）。經(jīng)Ficoll Hypaque（Gibco，USA）分離單個(gè)核細(xì)胞后，離心洗滌重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106～4×106個(gè)/ml鋪入6孔板，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，收集懸浮細(xì)胞至另一個(gè)50 ml離心管繼續(xù)培養(yǎng)；第3天補(bǔ)加樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）培養(yǎng)液；第5天加入腫瘤特異性抗原（終濃度為20～80μg/ml），誘導(dǎo)后12～16 h加入腫瘤壞死因子（TNF-α，500 U/ml）；第8天收集細(xì)胞，離心，洗滌，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，靜脈回輸患者，共4次，回輸時(shí)間選擇在2次DC回輸之間。

1.3.2細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞制備將經(jīng)Ficoll Hypaque（Gibco，USA）分離的單個(gè)核細(xì)胞重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，以2×106個(gè)/ml鋪入培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加γ-干擾素（INF-γ，1 000 U/ml），置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育；次日補(bǔ)加CD3單抗（0.5μg/ml）及白細(xì)胞介素-2（IL-2，1 000 U/ml）繼續(xù)培養(yǎng)；第3天用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)液；第11～12天收集細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer，CIK）細(xì)胞，離心，生理鹽水洗滌3次。用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸，總體積為100 ml，經(jīng)靜脈回輸患者，共4次，回輸時(shí)間選擇在2次DC回輸之間。

1.3.3DC-CIK回輸后效果分析如果輸入DC-CIK后患者有發(fā)熱等不舒服的感覺，各項(xiàng)化驗(yàn)有一定的改變，且對(duì)患者的生活有嚴(yán)重的影響，這些是評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

1.3.4患者血液中免疫指標(biāo)細(xì)胞對(duì)采集及分析在回輸DC-CIK之前7 d抽取患者血液，并于輸注DC -CIK細(xì)胞后14 d再次抽取血液，經(jīng)過處理后，分別加入管中，小管中加入血液及相應(yīng)的抗體，血液加100μl，抗體量為10μl，抗體分別是CD3-FITC、CD127-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、CD25-PE-Cy5，用IgGα1做相應(yīng)的對(duì)照，2者經(jīng)過反應(yīng)后，時(shí)間是15 min，反應(yīng)后再次經(jīng)過處理，上儀器檢測(cè)，檢測(cè)后行記錄數(shù)據(jù)分析總結(jié)。

1.3.5檢測(cè)Th1/Th2按前述回輸DC-CIK之前7 d抽取患者血液，并于輸注DC-CIK細(xì)胞后14 d再次抽取血液，經(jīng)過離心等處理后，留取患者血清，置入冰箱低溫冷凍備用。取ELISA試劑盒，按操作程序測(cè)定IFN-γ與IL-4血清中的含量，操作務(wù)求規(guī)范嚴(yán)密。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為自體配對(duì)均數(shù)的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1效果及副反應(yīng)

總體上，DC-CIK注入人體后，多數(shù)患者狀態(tài)有明顯改善，進(jìn)食增加、精力恢復(fù)、乏力倦怠癥狀消失，其中有個(gè)例患者有暫時(shí)的體溫升高現(xiàn)象，均未超過39℃，時(shí)間較短，應(yīng)用藥物后，體溫下降至正常，并沒有反復(fù)，全部患者無皮疹瘙癢等不良癥狀，各項(xiàng)化驗(yàn)指標(biāo)也未見顯著變化。

2.2患者免疫指標(biāo)評(píng)價(jià)

DC-CIK注入人體后，患者CD3+、CD4+百分比增加，CD8+百分比下降，CD4+/CD8+數(shù)值提高；標(biāo)志CD3+CD56+細(xì)胞數(shù)量提升；標(biāo)志CD127lowTreg CD25+CD4+細(xì)胞比例下降，相比注入CIK-DC細(xì)胞前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 患者輸注前后T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記的變化（%，n=30）

2.3細(xì)胞因子比較

CIK-DC細(xì)胞輸注組IFN-γ含量提高，IL-4含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 患者輸注前后外周血細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的比較（pg/ml，n=30）

3 討論

胰腺癌是消化道常見腫瘤，惡性程度高，治療困難，晚期放化療都難以延長(zhǎng)生存期，臨床及科研都在多方探索有效的療法。治療的主要難度在于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，手術(shù)前治療重點(diǎn)在局部，術(shù)后治療重點(diǎn)在于全身，近年開展的生物治療是有希望的全身治療辦法。

自身防御機(jī)制在抗腫瘤過程中發(fā)揮著不可替代的作用，T細(xì)胞在自身防御的過程中發(fā)揮著重要作用，癌癥之所以能發(fā)生、發(fā)展，在于機(jī)體免疫狀態(tài)有了問題，導(dǎo)致免疫監(jiān)視減弱，正常狀態(tài)下，人體免疫細(xì)胞量和功能都協(xié)調(diào)一致，能夠發(fā)揮正常的免疫機(jī)制，當(dāng)這種平衡被打破，免疫功能在一定程度上的缺失，至使腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸。實(shí)驗(yàn)證明，DC-CIK的輸注可以改善患者的免疫狀態(tài)，是一種有效的支持治療。患者免疫狀態(tài)的改善對(duì)患者的無病生存期及帶瘤生存期的延長(zhǎng)都有一個(gè)良好的預(yù)期。DC細(xì)胞是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。通過體外活化培養(yǎng)負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定數(shù)量后回輸給患者，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)[4]。最新研究顯示，DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，提高細(xì)胞的增殖速度和殺傷活性，且使其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更具特異性。對(duì)于血液、消化、呼吸等多個(gè)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用。CIK細(xì)胞最初是指在正常人體外周血中只占1%～5%的CD3+CD56+的T淋巴細(xì)胞，目前國(guó)內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的CIK細(xì)胞，實(shí)際上是體外擴(kuò)增以CD3+CD56+、CD3+CD8+為主的異質(zhì)性細(xì)胞群[5]。該細(xì)胞群具有廣泛的非MHC限制的極強(qiáng)的溶瘤活性。CIK增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞毒作用強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力很強(qiáng)，能精確“點(diǎn)射”腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)傷及“無辜”的正常細(xì)胞。能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，對(duì)手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，因此，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代的腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。

本文結(jié)果表明經(jīng)過以往的治療后，機(jī)體的免疫力受到不同程度的打擊和抑制，有些已不能進(jìn)行下一步治療。經(jīng)過DC-CIK細(xì)胞的提取和輸注后，CD3+、CD4+含量和CD4+/CD8+數(shù)值升高，共表達(dá)CD3+CD56+細(xì)胞含量顯著提高。CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷，在體內(nèi)受某些淋巴因子作用后，CIK細(xì)胞大量釋放具有細(xì)胞毒性的胞漿顆粒到胞外，這些顆粒直接破壞瘤細(xì)胞，進(jìn)入體內(nèi)活化的DC-CIK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素γ、TNF-α和IL-2等，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，而且還可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷腫瘤細(xì)胞。

1995年SAKAGUCHI等人首先提出CD4+CD25+Treg，引起免疫界越來越多的關(guān)注。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以維持自身免疫耐受，由于腫瘤抗原是自身抗原量或質(zhì)的改變，因此，可以推測(cè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制腫瘤免疫的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)無論癌癥患者還是腫瘤動(dòng)物模型，其外周CD4+CD25+Treg細(xì)

胞數(shù)量及功能均不同程度地增高，與患者死亡率增加，存活率降低密切相關(guān)。去除CD4+CD25+Treg細(xì)胞，利于誘導(dǎo)對(duì)多種腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，證明CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可能在腫瘤逃逸、促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，也可能是腫瘤疫苗和免疫增強(qiáng)劑難以奏效的原因。

文獻(xiàn)顯示CD4+CD25+CD127lowTreg是人體自有的，可以識(shí)別身體內(nèi)被激活的T淋巴細(xì)胞[6]，對(duì)Treg尤其可以區(qū)別，其特異性在目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞標(biāo)志中可以說是高的，而這種技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)在臨床中得到應(yīng)用，效果良好。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)三色標(biāo)記法檢測(cè)患者血液里CD4+CD25+CD127lowTreg含量，可以對(duì)Treg在血液中的含量反映得更精準(zhǔn)。上述研究檢測(cè)DC-CIK細(xì)胞輸注前后血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量，可以看出胰腺腫瘤患者輸注DC-CIK前血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量較多。DC-CIK細(xì)胞輸注2星期，患者血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量減少。因而，CIK細(xì)胞以減少Treg含量的方式增強(qiáng)患者的免疫功能。

人體的免疫結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞因子有著重要的地位。從產(chǎn)生細(xì)胞因子和其功能作用的區(qū)別，細(xì)胞可區(qū)分為Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞。Th1的細(xì)胞作用是使人免疫力更強(qiáng)，這類細(xì)胞可以分泌諸如IFN-γ、IL-2等因子；Th2細(xì)胞分泌諸如IL-4、IL-10等因子，在體液免疫中發(fā)揮關(guān)鍵效能。健康狀態(tài)下，人體處在一個(gè)免疫平衡狀態(tài)，Th1、Th2分別分泌增強(qiáng)免疫和抑制免疫的因子[7]，互相制衡。腫瘤患者疾病的開始及進(jìn)展均有Th1參與的免疫機(jī)能伴隨。上述通過檢測(cè)兩類細(xì)胞因子在血液中的含量，可以看出輸注DC-CIK細(xì)胞的患者，IFN-γ含量增加，IL-4含量減少。顯示DC-CIK細(xì)胞輸注在一定程度上影響著Th1/Th2的平衡，保持人體免疫狀態(tài)的平衡，促進(jìn)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。

總之，DC-CIK細(xì)胞輸注對(duì)增強(qiáng)胰腺腫瘤患者T淋巴細(xì)胞生理效能，減少患者血液中Treg的含量，同時(shí)使Th1/Th2的比例保守一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平起到關(guān)鍵作用。但是，上述論述所涉范圍有限，DC-CIK細(xì)胞對(duì)胰腺腫瘤患者更深層次的作用及效果還有待揭示。

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（張蕾 編輯）

Effect of dendritic cell-cytokine induced killer cells on human pancreatic cancer

Hong-chao ZHANG
(The First Department of General Surgery,Heilongjiang Provincial Hospital, Harbin,Heilongjiang 150300,P.R.China)

【Objective】To study the effect of dendritic cell-cytokine induced killer cells(DC-CIK)immunotherapy on immunity function of patients of pancreatic cancer.【Methods】A total of 30 patients with pathologically confirmed pancreatic cancer were treated with DC-CIK cell therapy.The levels of T cell subsets and CD4+CD25+CD127 low regulatory T cells were detected with flow cytometry and the IFN-γ and IL-4 were detected with ELISA in peripheral blood before and after treatment.【Results】The T cell subsets CD3+,CD4+and CD3+CD56+,and the ratio of CD4+/CD8+were increased after DC-CIK cell transfusion while the CD8+cell subset and CD4+CD25+CD127 low regulatory T cells were significantly decreased(P＜0.01).The level of IFN-γ was increased and the level of IL-4 decreased at the same time(P＜0.01).【Conclusions】DC-CIK cell immunotherapy can improve the immune function of patients with pancreatic cancer and enhance the anti-tumor effects,so it is one of means which can be used to treat patients with pancreatic cancer.

dendritic cell-cytokine induced killer cell;pancreatic cancer;T lymphocyte

R735.9

A

1005-8982（2015）27-0032-04

2015-03-14