杜江，張林

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 沈陽 110001）

·臨床論著·

高遷移率族蛋白AT-hook2在非小細胞肺癌患者血清中的表達及與預(yù)后的關(guān)系

杜江，張林

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 沈陽 110001）

目的探討非小細胞肺癌患者血清中不同時間高遷移率族蛋白AT-hook2（HMGA2）的表達情況，分析其與預(yù)后間的關(guān)系。方法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測術(shù)前、術(shù)后一周及術(shù)后一個月52例非小細胞肺癌（NSCLC）患者血清中HMGA2的表達情況。結(jié)果術(shù)前及術(shù)后一個月HMGA2在NSCLC患者血清中的表達均顯著高于對照組（t=2.541，t=2.384，P＜0.05）。術(shù)后一周HMGA2的表達水平較術(shù)前有顯著降低（t= 2.334，P＜0.05）而與對照組差異不大（t=1.138，P＞0.05）。術(shù)前及術(shù)后一個月HMGA2在血清中的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。術(shù)前和術(shù)后一個月HMGA2在血清中陽性表達者無病生存率（DFS）降低，而術(shù)后一個月HMGA2血清表達水平是獨立的預(yù)后影響因素（HR=2.31，95%CI：1.21～4.98，P＜0.01)。結(jié)論ELISA法檢測HMGA2在患者血清中的水平可以用來作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，指導(dǎo)治療。

高遷移率蛋白AT-hook2；轉(zhuǎn)移；酶聯(lián)免疫吸附試驗；無病生存率

轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)一直是肺癌診斷治療上的難點，目前還缺少敏感度較高的臨床檢測指標(biāo)。高遷移率族蛋白AT-hook2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是一種癌基因，在肺癌細胞及組織中高表達，其表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]，其表達含量有可能成為預(yù)測肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況的指標(biāo)。本實驗應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked im munosorbnent assay，ELISA）檢測方法，測定非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者在不同時期血清中HMGA2的表達水平，研究其與患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象

實驗組選取2010年6～9月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科接受手術(shù)治療并且由術(shù)前或術(shù)后病理證實為非小細胞肺癌的患者52例。其中男33例，女19例，年齡39～77歲，中位年齡57歲。所有患者術(shù)前均未行抗腫瘤治療。具體臨床病理資料見表1。對照組為16例體檢健康者，男8例，女8例，年齡33～65歲，中位年齡44歲。52例患者均獲得隨訪，隨訪時間6～38個月，中位隨訪時間22個月。

表1 患者基本臨床病理參數(shù)（n=52）

告知患者取得的所有標(biāo)本的目的與用途，可能的風(fēng)險和后果，并獲得患者的簽字同意，取得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器

HMGA2夾心法ELISA試劑盒（美國USCN公司），96孔酶標(biāo)板（美國Corning公司），低溫冷凍冰箱（德國Simens公司），高速離心機（日本Hitachi公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），自動洗板機（日本EKA公司）。

1.3血漿制備

分別于術(shù)前、術(shù)后1周及術(shù)后1個月（化療前），晨空腹常規(guī)靜脈采血2 ml，肝素抗凝，4℃，2 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80℃冰箱冷凍備用。對照組體檢時同法提取。術(shù)前、術(shù)后1周及術(shù)后1月復(fù)查時均獲得全部52例標(biāo)本。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗

嚴(yán)格按照HMGA2 ELISA Kit試劑盒所示步驟進行實驗。發(fā)光顯色后，酶標(biāo)儀在450 nm測定光密度（optical density，OD）值，取570 nm OD值為校正波長。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此計算各待測樣本的濃度。為便于生存分析，設(shè)定1.1 ng/ml為HMGA2表達的定性cut-off值，＞1.1ng/ml為陽性，＜1.1 ng/ml為陰性。

1.5隨訪方法

52位NSCLC患者，隨訪時間6～38個月，中位隨訪時間22個月，隨訪以復(fù)發(fā)時間為觀察終止時間，主要根據(jù)CT、PET-CT等影像學(xué)檢查結(jié)果判定是否復(fù)發(fā)。隨訪期間32例出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，總體復(fù)發(fā)率61.5%。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較及

配對樣本均數(shù)比較用t檢驗，多樣本均數(shù)比較用One-Way ANOVA檢驗。單因素生存率比較用Log-rank檢驗，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。多因素分析用Cox比例回歸風(fēng)險模型，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HMGA2在非小細胞肺癌患者血清中的變化

術(shù)前及術(shù)后1個月HMGA2在NSCLC患者血清中的表達均顯著高于對照組（t=2.541，t=2.384，P＜0.05）。術(shù)后1周HMGA2的表達水平較術(shù)前有顯著降低（t=2.334，P＜0.05）而與對照組差異不大（t= 1.138，P＞0.05），術(shù)后1個月較術(shù)后1周HMGA2表達水平有一定提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.375，P＞0.05）。見表2。

表2 NSCLC患者不同時期以及對照組HMGA2血清中表達情況（ng/ml±s）

表2 NSCLC患者不同時期以及對照組HMGA2血清中表達情況（ng/ml±s）

組別例數(shù)HMGA2濃度水平對照組160.73±0.37術(shù)前521.45±0.51術(shù)后1周520.98±0.25術(shù)后1個月521.17±0.44

表3 NSCLC患者外周血中HMGA2不同時期濃度與臨床病理特征的關(guān)系

2.2NSCLC患者血清中HMGA2濃度與臨床病理因素間的關(guān)系

術(shù)前HMGA2血清中濃度與年齡、性別、吸煙史、病理分型、分化程度和T分期無關(guān)，而與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期相關(guān)（t=4.783，t=3.112，P＜0.05）。術(shù)后1周復(fù)查HMGA2濃度則與所有納入的臨床病理因素?zé)o關(guān)（P＞0.05），特別是對有淋巴結(jié)

轉(zhuǎn)移和TNM分期較晚的患者濃度值較術(shù)前有顯著降低（t=0.759，t=0.574，P＞0.05）。而術(shù)后1個月復(fù)查淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和晚期NSCLC患者HMGA2在外周血中的表達重新出現(xiàn)相關(guān)性（t=3.795，t=3.227，P＜0.05）。見表3。

2.3NSCLC患者HMGA2在血清中的表達與無病生存率之間的關(guān)系

52例NSCLC患者，隨訪時間6～38個月，中位隨訪時間22個月，隨訪期間有32例復(fù)發(fā)，總體復(fù)發(fā)率61.5%。Kaplan-Meier法繪制無病生存率（disease-free survival，DFS）生存曲線，顯示術(shù)前及術(shù)后1個月HMGA2血清表達陰性者較表達陽性者38個月DFS明顯要高（χ2=6.45，χ2=8.24，P＜0.05）；而術(shù)后1周HMGA2血清表達陽性和陰性DFS無區(qū)別（χ2=0.059，P＞0.05），見附圖。Log-rank單因素差異性檢驗結(jié)果顯示術(shù)前HMGA2血清中濃度，術(shù)后1個月HMGA2血清中濃度，病理分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有DFS差異。進一步采用Cox模型多因素生存分析，結(jié)果顯示術(shù)后1個月HMGA2血清中濃度（HR=2. 31，95%CI:1.21～4.98，P＜0.01）、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為獨立的DFS影響因素。而其他變量包括年齡、性別、吸煙史、病理類型、病理分級、T分期不是獨立的DFS影響因素。

附圖 HMGA2陽性表達與陰性表達患者的無病生存率Kaplan-Meier曲線

3 討論

高遷移率族蛋白AT-hook2是高遷移率蛋白（HMG）家族中的一員，首先在發(fā)育期的間質(zhì)組織中被發(fā)現(xiàn)，而在成熟的細胞中很少表達[2]。它在多種細胞過程中承擔(dān)重要生物學(xué)作用，如基因調(diào)控，細胞周期，細胞分化以及病毒整合特別是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程等[2-4]。目前，已經(jīng)有大量的研究表明HMGA2是一種癌基因，在多種癌細胞及組織中被檢出，并且發(fā)現(xiàn)其表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-10]。在腫瘤發(fā)生過程中，它被miRNA-let7及miR154等miRNA負向調(diào)控[11-12]，同時也作為ceRNA（競爭性內(nèi)源性RNA）負作用于miRNA[13]。該發(fā)現(xiàn)表明HMGA2似乎是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要基因節(jié)點，其表達含量有可能成為預(yù)測肺癌發(fā)展水平的指標(biāo)。

癌基因蛋白在患者外周血中的表達往往是腫瘤細胞代謝，分泌或壞死的產(chǎn)物。已經(jīng)有人通過在乳腺癌外周血中檢測HMGA2的mRNA表達水平來評價其與預(yù)后的相關(guān)性。并且發(fā)現(xiàn)其表達與乳腺癌的分期，轉(zhuǎn)移和預(yù)后明顯相關(guān)[14]。在本實驗中，筆者使用HMGA2-ELISA試劑盒檢測不同時期外周血中HMGA2的表達水平[15]，結(jié)果顯示52例NSCLC患者術(shù)前及術(shù)后1個月外周血中HMGA2的平均表達水平高于16例健康人對照組的平均表達水平（P＜0.05）。但術(shù)后1周的NSCLC患者HMGA2的表達水平較術(shù)前顯著降低（P＜0.05），而與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果說明，在NSCLC患者血清中的HMGA2是高表達的，而手術(shù)切除腫瘤使得外周血中HMGA2表達水平有顯著的降低。術(shù)后1個月HMGA2的平均表達水平與術(shù)后1周的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明術(shù)后1個月HMGA2血清表達水平有所恢復(fù)。

對不同時期HMGA2血清中表達水平與臨床病理因素之間的關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)前HMGA2血清中表達水平與年齡、性別、吸煙史、病理分型、病理分級、T分期無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)

（P＜0.05）。術(shù)后1周血清中HMGA2表達水平與所有臨床病理因素?zé)o關(guān)。術(shù)后1個月血清中HMGA2表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。表明HMGA2在NSCLC患者血清中的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期相關(guān)，提示HMGA2參與NSCLC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。手術(shù)可能降低HMGA2的血清表達水平，在部分患者中控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

全部52例患者均獲得隨訪，隨訪截止于2013年11月。隨訪期間共32例復(fù)發(fā)，總體復(fù)發(fā)率61.5%。為驗證血清HMGA2表達與腫瘤復(fù)發(fā)情況之間的關(guān)系，根據(jù)對照組表達上限設(shè)定HMGA2濃度的cutoff值，并繪制血清HMGA2表達情況與無病生存率的Kaplan-Meier曲線。結(jié)果顯示，術(shù)前和術(shù)后1個月的血清HMGA2陽性表達與較低的DFS相關(guān)，而術(shù)后1周的表達水平則與DFS無關(guān)。對各臨床因素做Log-rank檢驗，術(shù)前血清HMGA2水平，術(shù)后1個月血清HMGA2水平，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期對DFS的影響存在差異（P＜0.05）。再將這些因素納入到Cox模型多因素生存分析，結(jié)果表明術(shù)后1個月血清HMGA2表達水平是獨立的預(yù)后風(fēng)險因素，表達陽性意味著術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性增大。該結(jié)果與相關(guān)實驗在乳腺癌血清中mRNA的表達結(jié)果一致[15]。證明HMGA2應(yīng)當(dāng)與NSCLC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)，并影響到患者的預(yù)后無病生存率。

雖然應(yīng)用RT-PCR法檢驗外周血中的mRNA含量進行HMGA2的檢測可能更精確，敏感性更強，但是高昂的價格阻礙它在臨床上的實際應(yīng)用[15-16]。本實驗應(yīng)用相對廉價的ELISA特異性試劑盒進行HMGA2血清濃度的檢測，方法成熟，操作簡單，并且實驗結(jié)果證明此法檢測出的HMGA2表達水平能夠?qū)颊咝g(shù)后是否復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移進行預(yù)測和判斷。進行多時段的HMGA2血清學(xué)檢測可以作為觀察NSCLC術(shù)后病情變化的重要指標(biāo)。

[1]MEYER B,LOESCHKE S,SCHULTZE A,et al.HMGA2 overexpression in non-small cell lung cancer[J].Mol Carcinog,2007, 46(7):503-511.

[2]BUSTIN M,REEVES R.High-mobility-group chromosomal proteins:architectural components that facilitate chromatin function[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1996,54:35-100.

[3]ADAIR JE,KWON Y,DEMENT GA,et al.Inhibition of nucleotide excision repair by high mobility group protein HMGA1[J]. J Biol Chem,2005,23(1):112-115.

[4]ADAIT JE,KWON Y,DEMENT GA,et al.Inhibition of nucleotide excision repair by high mobilitygroup protein HMGA1[J]. J Biol Chem,2005,280(37):32184-32192.

[5]DING X,WANG Y,MA X,et al.Expression of HMGA2 in bladder cancer and its association with epithelial-to-mesenchymal transition[J].Cell Prolif,2014,47(2):146-151.

[6]KLEMKE M,MULLER MH,WOSNIOK W,et al.Correlated expressionofHMGA2andPLAG1inthyroidtumors,uterine leiomyomas and experimental models[J].J PLoS One,2014,9(2): e88126.

[7]ZHU C,LI J,CHENG G,et al.miR-154 inhibits EMT by targeting HMGA2 in prostate cancer cells[J].Mol Cell Biochem, 2013,379(1/2):69-75.

[8]MULLER MH,DRIESCHNER N,FOCKEN T,et al.HMGA2 expression in the PC-3 prostate cancer cell line is autonomous of growth factor stimulation[J].J Anticancer Res,2013,33(8): 3069-3078.

[9]WU J,WEI JJ.HMGA2 and high-grade serous ovarian carcinoma[J].J Mol Med,2013,91(10):1155-1165.

[10]MORISHITA A,ZAIDI MR,MITORO A,et al.HMGA2 is a driver of tumor metastasis[J].Cancer Res,2013,73(14):4289-4299.

[11]ZHU C,LI J,CHENG G,et al.miR-154 inhibits EMT by targeting HMGA2 in prostate cancer cells[J].Mol Cell Biochem, 2013,379(1/2):69-75.

[12]LEE YS,DUTTA A.The tumor suppressor microRNA let-7 represses the HMGA2 oncogene[J].Genes Dev,2007,21(9):1025-1030.

[13]KUMAR MS,ARMENTEROS ME,EAST P,et al.HMGA2 functions as a competing endogenous RNA to promote lung cancer progression[J].Nature,2014,505(7482):212-217.

[14]韓猛,宋燕.RT-PCR檢測乳腺癌患者外周血HMGA2 mRNA表達的意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(10):1480-1482.

[15]張志強,何萍,隋承光,等.雙抗體夾心ELISA定量檢測血清Cap43蛋白方法的建立與評價[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(13): 1561-1564.

[16]何萍,張志強,戴曉淳,等.兩種方法檢測肺癌患者CAP43蛋白的結(jié)果比較[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(20):2477-2481.

（張蕾 編輯）

Expression of HMGA2 in peripheral blood and its correlation with prognosis of non-small cell lung cancer

Jiang DU,Lin ZHANG
(Department of Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of HMGA2 in non-small cell lung cancer(NSCLC) at different timing and its correlation with prognosis.【Methods】ELISA was performed to detect the expression of HMGA2 in the peripheral blood of 52 NSCLC before operation,one week after operation and onemonth after operation.The Kaplan-Meier curve and the Cox proportional hazards model were used to evaluate the prognostic role of each studied parameter.【Results】The expression of HMGA2 in NSCLC peripheral blood before operation and one month after operation was higher than that in the healthy controls(t=2.541 and 2.384 respectively,P＜0.05).The expression of HMGA2 one week after operation was significantly lower than that before operation(t=2.334,P＜0.05)and of no difference from that of the controls(t=1.138,P＞0.05).The expression level of HMGA2 was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM staging before operation(t=4.783 and 3.112,P＜0.05)and one month after operation(t=3.795 and 3.227,P＜0.05).There was no significant correlation with age,sex,T stage,histological type or differentiation grade(P＞0.05).Univariate analysis showed that the disease-free survival rate of the patients with negative HMGA2 expression was significantly higher than that of the patients with positive HMGA2 expression before operation and one month after operation(χ2=6.45 and 8.24 respectively,P＜0.05).Multivariate Cox regression analysis showed that high expression of HMGA2 one month after operation was a significant prognostic factor of low disease-free survival(HR=2.31,95%CI:1.21～4.98,P＜0.01).【Conclusion】The expression of HMGA2 in

HMGA2;metastasis;ELISA;disease-free survival

R734.2

A

1005-8982（2015）27-0027-05

2015-04-02

張林，E-mail：zhanglin_cmu@126.com，Tel：024-83283488

peripheral blood detected by ELISA could be considered as an important index for predicting prognosis of NSCLC.