馬軼杰，崔薇，李建華，馬獻(xiàn)昆，于立，蔡云鵬，王幫奎

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院1.神經(jīng)外科，2.干部保健科，新疆 烏魯木齊 830000）

·論著·

熱應(yīng)激預(yù)處理對創(chuàng)傷性休克大鼠早期腦組織中一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)與腦損傷的影響

馬軼杰1，崔薇2，李建華1，馬獻(xiàn)昆1，于立1，蔡云鵬1，王幫奎1

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院1.神經(jīng)外科，2.干部保健科，新疆 烏魯木齊 830000）

目的研究熱應(yīng)激預(yù)處理對創(chuàng)傷性休克早期大鼠腦組織一氧化氮（NO）濃度、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達(dá)量與腦組織病理改變的影響。方法96只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)均分為未處理組和處理組，每組又分別設(shè)未休克組、休克后0 h、1 h、2 h、3 h及4 h組6個亞組，熱應(yīng)激預(yù)處理后建立創(chuàng)傷性休克模型，留取腦組織，觀察腦組織病理學(xué)和檢測腦組織NO濃度、iNOS mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果病理觀察可見處理組各時間點腦病理損傷較未處理組病理損傷輕；NO濃度處理組均低于同時間點未處理組，休克后0 h時均有升高（P＜0.05），休克后1 h時腦組織NO濃度均有明顯降低（P＜0.05）；iNOS mRNA表達(dá)量處理組均低于同時間點未處理組，未處理組在休克后3 h出現(xiàn)一個峰值（3.50±0.150）u/mg·prot。結(jié)論熱應(yīng)激預(yù)處理能明顯降低創(chuàng)傷性休克大鼠早期腦組織中NO、iNOS的表達(dá),減輕創(chuàng)傷性休克早期大鼠腦損傷。

熱應(yīng)激；創(chuàng)傷性休克；腦；損傷

創(chuàng)傷性休克是由于機(jī)體遭受暴力作用后，造成重要臟器損傷、嚴(yán)重出血等情況，使患者有效循環(huán)血量銳減，微循環(huán)灌注不足，以及創(chuàng)傷后的劇烈疼痛、恐懼等多種因素綜合形成的機(jī)體代償失調(diào)的綜合征。研究表明，50%的戰(zhàn)傷死亡是急性失血所致，約1/3的創(chuàng)傷患者死于入院前失血性休克，發(fā)生在創(chuàng)傷后2 h內(nèi)的致死率為20%[1]，其中腦是最早出現(xiàn)損傷的器官之一。熱應(yīng)激是指機(jī)體在高環(huán)境溫度中做出的一系列非特異性全身應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，熱應(yīng)激預(yù)處理可激活機(jī)體內(nèi)在的保護(hù)性機(jī)制減輕創(chuàng)傷性腦損傷對機(jī)體的損害[2]，但熱應(yīng)激對創(chuàng)傷性休克后繼發(fā)性腦損傷的影響尚未見文獻(xiàn)報道，為觀察熱應(yīng)激對創(chuàng)傷性休克大鼠繼發(fā)性腦損傷的影響，本實驗通過高溫預(yù)處理后建立創(chuàng)傷性休克模型，探討熱應(yīng)激預(yù)處理對創(chuàng)傷性休克大鼠早期腦組織中一氧化氮（NO）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)及對腦損傷的影響，并對其變化規(guī)律進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組

實驗使用SPF級SD雄性大鼠（n=96，年齡8～10周，體重280～320 g）從新疆疾控中心購得。自購入后適應(yīng)實驗室環(huán)境1周，飼養(yǎng)環(huán)境保持：溫度（22± 1）℃，相對濕度（50±5）%，大鼠由無菌飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。實驗大鼠隨機(jī)分成兩組：處理組和未處理組，每組又分別設(shè)未休克組、休克后0、1、2、3 h及4 h組6個亞組，每組8只。

1.2主要實驗器材及環(huán)境

BL-420F生物機(jī)能監(jiān)測系統(tǒng)（成都泰盟公司），BI-2000電子計算機(jī)圖像分析儀（成都泰盟公司），酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司），CS1O1-2D型電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶四達(dá)實驗儀器廠），NO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），iNOS引物（上海生物工程有限公司合成），正向引物：5'-GAAAGC GGTGTTCTTTGCTTCT-3'，反向引物：5'-CTTATCTG TTCCATGCAGACAACCT-3'；β-actin正向引物：5'-AACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向引物：5'-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3'。

1.3實驗方法

1.3.1模型制作實驗前大鼠常規(guī)禁食、禁水6 h。處理組大鼠置于鐵籠中放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)使其肛溫緩慢達(dá)到42℃并維持15 min，參照孫英剛等[3]建立的創(chuàng)傷失血性休克模型，3%戊巴比妥腹腔麻醉，使用靜脈留置針行右頸動、靜脈和右股動脈插管，右頸動脈插管接生物機(jī)能監(jiān)測系統(tǒng)測量血壓等血流動力學(xué)指標(biāo)，頸靜脈插管建立簡易補液通道，右股動脈插管以備放血。大鼠穩(wěn)定10 min后，利用2 500 g鐵輪于30 cm高度擊中大鼠左下肢股骨中上段造成粉碎性骨折，致傷后簡易包扎傷口；經(jīng)右股動脈放血使平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）維持在（35± 5）mmHg，若經(jīng)打擊后血壓不能維持則通過補液通道輸注生理鹽水以維持MAP。模型完成時間控制在15～20 min，并以大鼠MAP達(dá)到（35±5）mmHg為休克0 h時間點。未處理組除不進(jìn)行熱應(yīng)激處理外，其方法同處理組，兩組中未休克組除不致傷外其余步驟同各實驗組。

1.3.2腦組織取樣按休克后5個時間點處理各組大鼠，達(dá)到休克維持時間點后馬上切取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，其余腦組織置于-80℃凍存，兩組中未休克組在插管完成后即進(jìn)行取樣。

1.4觀測指標(biāo)及方法

1.4.1腦組織NO測量稱取0.1g腦組織，在4℃生理鹽水中漂洗、拭干，于玻璃勻漿管中手工勻漿，用1 ml生理鹽水沖洗轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi)制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，測定光密度（optical density，OD）值，計算各樣本濃度。

1.4.2腦組織iNOS mRNA表達(dá)量提取腦組織總RNA并測量濃度，計算20μl反轉(zhuǎn)錄體系所需體積，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后以反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA為模板配成20μl體系，設(shè)定擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min；95℃預(yù)變性10 s，60℃復(fù)性30 s，75℃延伸10 s，共41個循環(huán)；最后于75℃延伸10 min，得出iNOS和內(nèi)參β-actin的Ct值。

1.4.3病理學(xué)變化包埋好的腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察組織病理變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腦組織NO濃度

未處理組和處理組休克后各時間點腦組織NO

濃度均高于未休克組（P＜0.05）；處理組在休克后腦組織NO濃度均低于未處理組；未處理組和處理組在休克后0 h時腦組織NO濃度有顯著升高（P＜0.05），在休克后1 h時腦組織NO濃度均有明顯降低（P＜0.05），隨時間推移腦組織中NO濃度都逐漸升高，但未處理組升高更明顯（見圖1）。

圖1 腦組織NO濃度比較

2.2腦組織iNOS mRNA表達(dá)量

未處理組和處理組在休克后各時間點均高于未休克組（P＜0.05），處理組休克后均低于未處理組，未處理組在休克后3 h出現(xiàn)一個峰值（3.50±0.150）u/mg·prot，而處理組則未出現(xiàn)；未處理組休克后各時間點較前一時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而處理組差異則不明顯（見圖2）。

圖2 腦組織iNOS mRNA表達(dá)量比較

2.3病理學(xué)變化

顯微鏡下發(fā)現(xiàn)處理組未休克組，休克后0h組和1h組腦實質(zhì)無水腫，神經(jīng)細(xì)胞無變化；休克后2 h組腦組織實質(zhì)輕度水腫，休克后3 h組和4 h組腦組織實質(zhì)輕度水腫，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生。未處理組在休克后0 h即出現(xiàn)腦組織實質(zhì)輕度水腫，休克后1 h腦組織腫脹，部分神經(jīng)細(xì)胞核消失，隨時間推移腦組織變化明顯；處理組各時間點病理變化較未處理組輕（見圖3）。

圖3 腦組織切片（HE×200）

3 討論

熱應(yīng)激是機(jī)體暴露在熱環(huán)境中產(chǎn)生的一系列非特異性全身反應(yīng)，多種細(xì)胞因子在熱應(yīng)激發(fā)生發(fā)展的病理過程起重要作用。創(chuàng)傷性休克會導(dǎo)致有效血容量明顯減少、血流灌流不足、微循環(huán)障礙，若無法及時得到有效救治，2 h內(nèi)的致死率為20%[1]，其中腦是最早出現(xiàn)損傷的器官之一。以往研究證實熱應(yīng)激可以提高機(jī)體對于有害刺激的耐受力，但對熱應(yīng)激早期影響的報道較少，本實驗在經(jīng)典熱應(yīng)激大鼠模型基礎(chǔ)上造成創(chuàng)傷性休克，觀察早期腦損傷的特點。

本實驗發(fā)現(xiàn)，處理組腦病理損傷較未處理組輕，未處理組可見腦組織腫脹，部分神經(jīng)細(xì)胞核消失，隨時間推移腦組織變化明顯。創(chuàng)傷性休克大鼠致傷前給予熱應(yīng)激處理減輕腦損傷的程度，這可能是由于熱應(yīng)激預(yù)處理誘導(dǎo)熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）表達(dá)增加，HSP是一組非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，有多種功能，因應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體表達(dá)熱休克蛋白增加機(jī)體細(xì)胞耐受不利因素的作用，減輕不利因素對機(jī)體細(xì)胞的損傷[4]，可見熱應(yīng)激預(yù)處理的保護(hù)作用是體現(xiàn)在多方面的，包括減輕腦組織的出血、水腫和炎癥細(xì)胞浸潤。

NO是機(jī)體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子且具有多種生理功能，NO產(chǎn)生過量可激發(fā)氧化應(yīng)激加

重組織損傷[5]，目前不少研究發(fā)現(xiàn)，各種傷害刺激包括生物、物理及化學(xué)等因素可誘發(fā)動物腦內(nèi)各區(qū)NO顯著升高[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，未處理組與處理組NO濃度比較存在顯著差異，兩組在休克后各時間點均高于未休克組，未處理組休克后均高于處理組；另外未處理組與處理組iNOS mRNA表達(dá)量同時間點比較存在差異，且各時間點均高于未休克組，未處理組均低于同時間點處理組，未處理組在休克后3 h出現(xiàn)一個峰值（3.50±0.15）u/mg·prot，而處理組則未出現(xiàn)，未處理組休克后各時間點較前一時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而處理組差異則不明顯。有研究[8]表明，由iNOS激活產(chǎn)生的NO呈現(xiàn)神經(jīng)毒性作用，損傷腦血管內(nèi)皮的完整性，使其通透性增加導(dǎo)致腦水腫。由此可見，未處理組隨著休克時間的延長，可能是由于創(chuàng)傷性休克進(jìn)而激發(fā)iNOS表達(dá)量增加，NO大量產(chǎn)生，進(jìn)而生成強(qiáng)毒性的氧自由基造成腦的廣泛性損傷，而處理組由于熱應(yīng)激作用使大鼠機(jī)體增加對休克的耐受能力，或者是熱應(yīng)激抑制iNOS/NO途徑，從而與未處理組比較iNOS的表達(dá)明顯降低。

另外，未處理組與處理組NO濃度在休克后0 h時均有顯著升高，應(yīng)考慮是在建立創(chuàng)傷性休克模型過程中，由于有效循環(huán)血量銳減、劇烈疼痛等多種因素導(dǎo)致大鼠為維持正常生理狀態(tài)產(chǎn)生過多NO所引起；未處理組與處理組NO濃度在休克后1 h時均有顯著降低，以往有學(xué)者研究[9]表明，在應(yīng)激和一些疾病條件下，NO的合成明顯升高，似乎與以往的研究結(jié)果矛盾，但以往研究多為NO在應(yīng)激、創(chuàng)傷或疾病幾天后的變化，最早也是在4～6 h。休克后NO濃度下降的原因可能是由于熱應(yīng)激或者創(chuàng)傷休克時，由于機(jī)體大量出汗或血容量的減少造成NO丟失[10]；熱應(yīng)激使機(jī)體產(chǎn)生大量的熱休克蛋白[11]，HSP可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制iNOS的表達(dá)，而細(xì)胞因子對NO合成的促進(jìn)作用恰是通過高水平的iNOS mRNA來實現(xiàn)的，因此在應(yīng)激早期，HSP對NO生成起到一種抑制作用，而且處理組較未處理組降低得更顯著，說明熱應(yīng)激預(yù)處理誘導(dǎo)機(jī)體合成更多的HSP。

綜上所述，熱應(yīng)激預(yù)處理能明顯降低創(chuàng)傷性休克大鼠早期腦組織中NO、iNOS的表達(dá)，對創(chuàng)傷性休克大鼠腦損傷有明顯的保護(hù)作用，為創(chuàng)傷性休克提供一種早期預(yù)防和救治措施。

[1]VILLELA NR,TSAI AG,CABRALES P,et al.Improved resuscitation from hemorrhagic shock with Ringer's lactate with increased viscosity in the hamster window chamber Model[J].J Trauma,2011,71(2):418-424.

[2]SHOHAMI E,HOROWITZ M.Intrinsic Neuroprotection in Traumatic Brain Injury[M].Innate Tolerance in the CNS.Springer New York,2013:499-519.

[3]孫英剛,黃宗海,馮浩森,等.創(chuàng)傷性休克大鼠模型建立[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2002,27(12):1086-1087.

[4]MEHTA S.The effects of nitric oxide in acute lung injury[J]. Vascul Pharmacol,2005,43(6):390-403.

[5]ANCTIL M,POULAIN I,PELLETIER C.Nitric oxide modulates peristaltic muscle activity associated with fluid circulation in the sea pansy Renilla koellikeri[J].J Exp Biol,2005,208(pt 10): 2005-2017

[6]KURT M,BILGE SS,KUKULA O,et al.The role of nitrergic system in lidocaine-induced convulsion in the mouse[J].Jpn J Pharmacol,2001,85(1):92-94.

[7]FARADJIH,ROUSSETC,DEBILLYG,etal.Sleepand epilepsy:a key role for nitric oxide[J].Epilepsia,2000,41(7): 794-801.

[8]SCORZIELLO A，PELLEGRINI C，SECONDO A，et al.Neuronal NOS activation during oxygen and glucose deprivation triggerscerebellargranulecelldeathinthelaterreoxygenation phase[J].J Neurosci Res,2004,76(6):812-821.

[9]FALETI AG,MASTRONARDI CA,LOMNICZI A.Beta-Endorphin blocks luteinzig hormoner leasing hormoner release by inhibiting the nitric oxide pathway controlling its release[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(4):1722-1726.

[10]RODEBERG DA,CHAET MS,BASS RC,et al.Nitric oxide:a review[J].Am J Surg,1995,170(3):292-303.

[11]HASHIGUCHI N,OGURA H,TANAKA H,Enhanced expression of heat shock proteins in leukocytes from trauma patients[J]. J Trauma,2001,50(1):102-107.

（張蕾 編輯）

Changes of NO and iNOS expression in brain tissue and injury of brain in traumatic shock rats preconditioned with heat stress

Yi-jie MA1,Wei CUI2,Jian-hua LI1,Xian-kun MA1,Li YU1, Yun-peng CAI1,Bang-kui WANG1
(1.Department of Neurological Surgery,2.Department of Geriatrics,Bingtuan Hospital of Production and Construction of Xinjiang,Urumqi,Xinjiang 830000,P.R.China)

【Objective】To research nitric oxide(NO)concentration,induced nitric oxide synthase(iNOS) mRNA expression and the pathological changes of brain tissue in traumatic shock rats preconditioned with heat stress.【Methods】A total of 96 male SD rats were randomly divided into untreated group and treatment group with equal number,and each group was equally divided into 6 subgroups:no shock group and shock 0 h group,1 h group,2 h group,3 h group and 4 h group.The model of traumatic shock was established after heat stress pretreatment and the brain tissue was taken for observation of pathological changes and detection of NO and iNOS mRNA expression in brain tissue.【Results】The lesions of brain tissue structure were lighter in the treatment group than those of the untreated group at the corresponding time point.The NO concentration of the treatment group was lower than that of the untreated group at the corresponding time point,both groups had a rise at shock 0 h(P＜0.05)and a reduce at shock 1 h(P＜0.05).INOS mRNA expression of the treatment group was lower than that of the untreated group at the corresponding time point, there was a peak value[(3.50±0.150）U/mg·prot]in the untreated group in 3 h.【Conclusion】Heat stress pretreatment can significantly reduce NO concentration and iNOS mRNA expression in brain tissue and alleviate the brain injury of rats in early stage of traumatic shock.

heat stress;traumatic shock;brain;injury

R641；R-332

A

1005-8982（2015）27-0014-04

2015-03-17

李建華，E-mail：lijh_2008@126.com