陳 計(jì)，高 鵬，陸兆新，呂鳳霞，張 充，趙海珍，別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

β-1,3-1,4-葡聚糖酶高產(chǎn)菌誘變選育及基因克隆表達(dá)

陳 計(jì)，高 鵬，陸兆新，呂鳳霞，張 充，趙海珍，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為獲得β-1,3-1,4-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株，以高地芽孢桿菌YC-9為出發(fā)菌株，通過(guò)亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）和低能N+束誘變育種，篩選和選育得到兩株突變株N-2-2 和10-30s-3，發(fā)酵培養(yǎng)60 h，酶 活力分別達(dá)到28.6 U/mL和36.1 U/mL ，分別是出發(fā)菌株的2.36 倍和2.98 倍，與YC-9菌株相比，突變菌株菌體生長(zhǎng)下降但發(fā)酵產(chǎn)酶量增加。進(jìn)一步將β-1,3-1,4-葡聚糖酶克隆并在大腸桿菌中成功表達(dá)，經(jīng)過(guò)30 ℃誘導(dǎo)6 h后，胞內(nèi)酶活力達(dá)79.2 U/mL，為出發(fā)菌株的6.5 倍。

高地芽孢桿菌；β-1,3-1,4-葡聚糖酶；亞硝基胍誘變；低能N+束注入；異源表達(dá)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-D-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.73）分解β-1,3-1,4-葡聚糖中與β-D-1,3糖苷鍵相鄰的β-D-1,4-糖苷鍵，降解產(chǎn)物主要是纖維三糖和纖維四糖，因其主要分解大麥中的β-1,3-1,4-葡聚糖和細(xì)菌地衣多糖，所以又稱(chēng)地衣多糖酶[1]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶，在啤酒釀造中，主要用于改善啤酒的混濁度，提高產(chǎn)品質(zhì)量[2]，在飼料工業(yè)中，主要用作飼料添加劑，可有利于動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高生長(zhǎng)性能和糧食的轉(zhuǎn)化率[3]。迄今為止，β-1,3-1,4-葡聚糖酶已在芽孢桿菌、曲霉、毛霉、青霉和瘤胃微生物中得到廣泛的發(fā)現(xiàn)[4-7]，然而大部分原始菌株的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力或者熱穩(wěn)定性較低，這就限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用?，F(xiàn)階段，提高酶表達(dá)量或者酶活的方法主要有：遺傳育種、異源表達(dá)以及酶分子的定向和非定向改造。其中傳統(tǒng)誘變育種因其成本低廉、方法簡(jiǎn)便、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，至今仍在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用[8-10]。而通過(guò)分子生物學(xué)手段，將外源酶基因?qū)胨拗骶瑯?gòu)建異源表達(dá)系統(tǒng)，已成為當(dāng)今科研界提高酶表達(dá)量的基本策略。

本課題組Mao Shurui等[11]在前期篩選和鑒定了產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高地芽孢桿菌YC-9，但原始菌株的酶表達(dá)量較低。本研究以高地芽孢桿菌YC-9為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行了誘變育種，并將β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

高地芽孢桿菌YC-9（Bacillus altitudinis YC-9，保藏號(hào)CGMCC4314）、 Escherichia coli DH5α克隆宿主與Escherichia coli BL21（DE3） pLysS表達(dá)宿主為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；LB培養(yǎng)基（液體）：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；初篩培養(yǎng)基：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、地衣多糖1 g、剛果紅0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

克隆載體p M D 1 9-T載體、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、X-Gal、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 寶生物工程（大連）有限公司；表達(dá)載體pET-28a（+） 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房云彬所贈(zèng)；地衣多糖（lichenan） 愛(ài)爾蘭Megazyme公司；X-Gal/IPTG Premix、dNTP、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker 南京金斯瑞公司；DNA凝膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨等 英國(guó)Oxoid公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH計(jì) 美國(guó)Orion公司；GXZ-9240 MBE恒溫干燥箱、PYX-DHS-50X65隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；PTC-100TMPCR熱循環(huán)儀、PowerPacTMHC電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[12]。酶活力單位定義為：在60 ℃、pH 7.0條件下每分鐘從底物中釋放1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品的酶活力/（U/mL）；n為稀釋倍數(shù)；ρ為由回歸方程計(jì)算出的葡萄糖的含量/（mg/mL）；10為反應(yīng)時(shí)間，取10 min；M表示葡萄糖的分子質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.2 高地芽孢桿菌的亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）誘變

稱(chēng)取20 mg固體NTG溶于10 mL丙酮，使NTG溶液初始質(zhì)量濃度為2 mg/mL。分別取NTG母液0.20、0.15、0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0 mL加入9 個(gè)4 mL離心管中，再吸取1 mL菌液加到各個(gè)離心管里，反應(yīng)體系為2 mL，體積不夠2 mL的用pH 6的緩沖液補(bǔ)足。37 ℃反應(yīng)30 min后取100 μL稀釋菌液涂布平板，37 ℃培養(yǎng)、挑單菌落、初篩、復(fù)篩。

1.3.3 高地芽孢桿菌的低能N+束注入誘變

本實(shí)驗(yàn)所用的離子束輻照設(shè)備由南京工業(yè)大學(xué)提供，采用低能N+注入，注入能量為10 keV和20 keV。將需離子注入的樣品培養(yǎng)皿疊放在對(duì)照培養(yǎng)皿上方，一起放入離子注入機(jī)靶室，打開(kāi)上方培養(yǎng)皿蓋，靶室抽真空。在兩個(gè)能量條件下，放置時(shí)間分別是0、30、60、90 s。隨后吸取1 mL無(wú)菌水洗脫誘變后的菌膜成為1 mL菌液，取100 μL稀釋菌液涂布平板，37 ℃培養(yǎng)、挑單菌落、初篩、復(fù)篩。

1.3.4 初篩和復(fù)篩

取100 μL稀釋菌液涂布平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)。用滅菌的牙簽挑取單菌落點(diǎn)種于初篩平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺量取菌落周?chē)乃馊Γ羧∷馊Υ蟮木曜鳛閺?fù)篩菌株，并分別按公式（2）、（3）計(jì)算致死率、突變率[13]。

式中：N為對(duì)照組單菌落數(shù)/（CFU/mL）；N′為誘變處理樣品單菌落數(shù)/（CFU/mL）；N”為突變菌落數(shù)/（CFU/mL）。

將經(jīng)初篩得到的菌株于50 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)6 h左右，至OD600nm值為0.6～0.8，制備種子液；再按2%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)60 h。發(fā)酵培養(yǎng)液于5 000×g離心15 min，取上清液測(cè)酶活力。

1.3.5 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將誘變篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔24 h傳代1 次，共傳6 代，然后將每一代菌株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，根據(jù)酶活大小檢測(cè)菌株的傳代穩(wěn)定性。

1.3.6 誘變菌株與原始菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)酶情況比較

將經(jīng)NTG誘變和低能N+束誘變得到的菌株N-2-2和10-30s-3，以及原始菌種高地芽孢桿菌YC-9分別接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)6 h左右至OD600nm值為0.6～0.8，制備種子液；再按2%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)60 h，每隔6 h取樣3 mL，于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)600 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體濃度，同時(shí)將所取樣品于5 000×g離心15 min，取上清液測(cè)酶活力，比較誘變后得到的菌株與原始菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)酶情況差異。

1.3.7 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank登錄的高地芽孢桿菌YC-9 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier 5及DNAMAN等生物軟件，設(shè)計(jì)β-1,3-1,4-葡聚糖酶擴(kuò)增引物：上游引物bgl-F：5′-CGGATCCATGTCTTACCGTGT GAAACGAATG-3′，下游引物bgl-R：5′-CCGCTCGAG TTATCTTTTTGTGTAACGTACC-3′，下劃線(xiàn)分別為酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，酶切位點(diǎn)前為保護(hù)堿基。以高地芽孢桿菌YC-9基因組為模板，以bgl-F、bgl-R為引物，擴(kuò)增β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖回收預(yù)期大小的片段，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上，挑選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得重組克隆載體pMD19-T-bgl。

1.3.8 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將獲得的pMD19-T-bgl用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，并與同樣經(jīng)過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ雙切的載體pET-28a（+）進(jìn)行16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后。挑選陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）電泳檢測(cè)β-1,3-1,4-葡聚糖酶在E. coli BL21中的表達(dá)

將β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因重組菌株E. coli BL21（pET-28a-bgl）和參照菌株E. coli BL21（pET-28a（+）），分別接種一環(huán)到加有50 μg/mL Kan的液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；然后按2%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL含有相同量Kan的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至菌體質(zhì)量濃度0.6～0.8 μg/mL，然后加入IPTG至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，離心棄上清，用細(xì)胞破碎液懸浮細(xì)胞，置于細(xì)胞破碎儀下破碎，破碎完，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠的SDS-PAGE，樣品加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min后，上樣15 μL進(jìn)行電泳。BL21菌株除了不加抗生素外，其他操作與重組菌株和參照菌株一致。

1.3.10 不同溫度下工程菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶情況

將β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因重組菌株E. coli BL21（pET-28a-bgl）接種一環(huán)到加有50 μg/mL Kan的液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；然后按2%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL含有相同量Kan的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至菌體OD600nm值為0.6～0.8，然后加入IPTG至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，分別于37、30、16 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。離心棄上清，用細(xì)胞破碎液懸浮細(xì)胞，置于細(xì)胞破碎儀下破碎，破碎完，離心取上清液，測(cè)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 NTG誘變后的致死率、正負(fù)突變率及復(fù)篩結(jié)果

圖1 NTG誘變后的致死率和正負(fù)突變率Fig.1 Mortality, positive and negative mutation rates after NTG mutagenesis

由圖1可知，隨著NTG質(zhì)量濃度的升高，致死率不斷提高，正突變率整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在NTG質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)最大，因此確定該質(zhì)量濃度為后續(xù)NTG誘變時(shí)的最佳處理?xiàng)l件。經(jīng)過(guò)兩輪誘變篩選，獲得一株產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活性較原始菌株有較大提高的菌株，并命名為N-2-2，酶活力為（28.6±1.2）U/mL，較原始菌株酶活力（（12.1±1.3）U/mL）提高136%。

2.2 低能N+束注入誘變后的致死率及復(fù)篩結(jié)果

圖2 N 2 N+束注入誘變處理結(jié)果Fig.2 Mortality after N+beam implantation

由圖2可知，在注入能量為20 keV條件下，注入30 s時(shí)，致死率已高達(dá)80%以上，說(shuō)明該能量條件下，注入較短時(shí)間，已產(chǎn)生較大的致死效應(yīng)，因此不適合本實(shí)驗(yàn)菌株的誘變；當(dāng)注入能量為10 keV時(shí)，在注入時(shí)間分別為30、60、90 s時(shí)，致死率分別為10.1%、21.5%、74.7%，隨著注入時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率不斷增加，可以看出此注入能量適合本實(shí)驗(yàn)菌株的誘變。本次N+注入誘變的出發(fā)菌株為NTG誘變后獲得的菌株N-2-2，經(jīng)過(guò)一輪N+注入誘變，在注入能量為10 keV，注入時(shí)間為30 s條件下，篩選出一株產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力較出發(fā)菌株N-2-2提高26.2%的菌株，命名為10-30s-3，該菌株酶活力達(dá)（36.1±2.5）U/mL，是原始菌株的2.98 倍。

2.3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖3 突變株遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of the two mutants and the original strain

由圖3可知，搖瓶發(fā)酵時(shí)，誘變菌株N-2-2、10-30s-3的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力一直高于原始菌株，在傳6 代時(shí)，酶活力都維持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍，能夠較穩(wěn)定遺傳，說(shuō)明誘變提高了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產(chǎn)量。

2.4 誘變菌株與原始菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)酶情況比較

圖4 菌株N-2-2、10-30s-3及原始菌株生長(zhǎng)情況比較Fig.4 Comparison of the growth characteristics of the mutant strains and the parent strain

圖5 菌株N-2-2、10-30s-3及原始菌株產(chǎn)酶情況比較Fig.5 Comparison of the enzyme production of the mutant strains and the parent strain

由圖4可知，3 株菌株的生長(zhǎng)情況大致可分為以下3 個(gè)階段，在0～12 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在12～48 h處于相對(duì)穩(wěn)定期，在48～72 h處于明顯衰亡期。在對(duì)數(shù)期，誘變菌株N-2-2和10-30s-3的生長(zhǎng)速率明顯高于原始菌株YC-9；在穩(wěn)定期，3 株菌株活菌數(shù)均在下降，但誘變菌株N-2-2和10-30s-3的下降趨勢(shì)較原始菌株YC-9要更明顯；在培養(yǎng)24 h后，誘變菌株N-2-2和10-30s-3的活菌數(shù)始終低于原始菌株YC-9。由圖5可知，誘變菌株和原始菌株的產(chǎn)酶特征較一致，均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力不斷增加，并且大致都在發(fā)酵60 h左右，酶活力達(dá)到最大值；但每一取樣點(diǎn)，誘變菌株的酶活力都高于原始菌株；綜上，突變菌株與原始菌株在生長(zhǎng)和產(chǎn)酶上有著較大的差異，即突變菌株生長(zhǎng)速率高于原始菌株，且下降趨勢(shì)更快，除此之外，突變菌株在生長(zhǎng)不斷下降的時(shí)候，酶活力上升趨勢(shì)卻快于原始菌株。

2.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的擴(kuò)增

圖6 6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的擴(kuò)增Fig.6 Amplifi cation of β-1,3-1,4-glucanase gene

利用引物bgl-F/bgl-R擴(kuò)增得到的陽(yáng)性條帶大小在750 bp左右，如圖6所示，與目的基因β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大?。?32 bp，編碼243 個(gè)氨基酸）基本相符，測(cè)序驗(yàn)證，成功擴(kuò)增出β-葡聚糖酶基因。

2.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

圖7 重組質(zhì)粒pET28a（+）-bgl的雙酶切鑒定Fig.7 Identifi cation of recombinant plasmid pET28a-bgl digested with BamHⅠ and XhoⅠ

將雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確的pMD19-T-bgl和載體pET-28a（+）分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收相應(yīng)片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒。將抽提的質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到了750 bp左右和5 000～6 000 bp左右的條帶（圖7），證實(shí)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因成功插入載體pET-28a（+），將重組質(zhì)粒命名為pET-28a-bgl。

2.7 SDS-PAGE電泳檢測(cè)β-1,3-1,4-葡聚糖酶在E. coli BL21中的表達(dá)

圖8 SDS-PAGE電泳檢測(cè)-1,3-1,4-葡聚糖酶在重組E. coli BL21中的表達(dá)Fig.8 SDS-PAGE analysis of β-1,3-1,4-glucanase expression in recombinant E. coli BL21

由圖8可知，工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）中有一條較深的與27 kD的理論分子質(zhì)量相近的蛋白條帶（箭頭所示），而E. coli BL21和E. coli BL21（pET-28a（+））中未見(jiàn)相應(yīng)的條帶，該結(jié)果表明β-1,3-1,4-葡聚糖酶重組載體pET-28a-bgl在E. coli BL21中成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。Mao Shurui等[11]用pET-32a（+）也實(shí)現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)，由于pET-32a（+）帶有18 kD的融合表達(dá)標(biāo)簽（Trx·Tag/His·Tag/S·Tag），使得表達(dá)后的酶蛋白以大小45 kD左右的形式出現(xiàn)。而本研究所用表達(dá)載體為pET-28a（+），由于不含Trx·Tag/S·Tag等標(biāo)簽，使得所表達(dá)的重組蛋白以更接近原始蛋白大小的形式出現(xiàn)。

2.8 不同溫度下工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）誘導(dǎo)產(chǎn)酶情況

圖9 不同溫度下工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）誘導(dǎo)產(chǎn)酶比較Fig.9 Induced production of the enzyme in E. coli BL21 (pET-28a-bgl) at different temperatures

由圖9可知，30 ℃更適合工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）的誘導(dǎo)產(chǎn)酶，且在誘導(dǎo)6 h后，酶活力達(dá)79.2 U/mL，是原始菌株的6.5 倍。

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)β-1,3-1,4-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的誘變選育還鮮有報(bào)道。本研究利用NTG處理原始菌株，獲得了一株β-1,3-1,4-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株，酶活力為原始菌株的2.36 倍，結(jié)果表明，利用單一誘變劑或誘變方式對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，即可獲得高產(chǎn)突變株。通常菌株在經(jīng)過(guò)同一誘變劑的多輪處理后會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐受性，因而若想進(jìn)一步提高突變株產(chǎn)量，需選擇其他誘變劑或誘變方式，在這方面國(guó)內(nèi)外已經(jīng)取得了良好的結(jié)果[14-15]。因此，本研究在NTG誘變處理的基礎(chǔ)上，再用N+束處理獲得的突變株，但是效果并不理想，所篩選出的一株酶活力提高最高的突變株，較出發(fā)菌株相比，也只提高了26.2%，結(jié)果表明，有些情況下，多種誘變劑或誘變方式依次或者復(fù)合對(duì)菌株進(jìn)行處理，并不一定能夠得到高產(chǎn)菌株，有時(shí)甚至?xí)a(chǎn)生較高的負(fù)效應(yīng)[16]。所有這些都提示誘變育種是一項(xiàng)復(fù)雜的科研工作，存在一定的偶然性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變菌株的生長(zhǎng)特點(diǎn)和產(chǎn)酶性能與原始菌株有較大的差異，這種誘變后出現(xiàn)的生長(zhǎng)代謝差異在其他報(bào)道中也有提及，例如，萬(wàn)濤等[17]利用激光誘變石油脫硫菌 cordonia sp. WQ-01后獲得的突變株，延滯期較短，對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)更快﹑降解二苯并噻吩（dibenzothiophene，DBT）的速率更高，但對(duì)于這些改變的深層次原因尚不清楚，因此有待于進(jìn)一步的研究。而與傳統(tǒng)的誘變育種相比，利用基因工程手段，異源表達(dá)酶基因，周期更短，效果更明顯[18-20]，更不具有菌株退化甚至回復(fù)突變的可能，已成為提高目標(biāo)物產(chǎn)量的首選。因此，本研究在對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變后，又利用基因工程技術(shù)，將來(lái)自高地芽孢桿菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因成功地在大腸桿菌中進(jìn)行了克隆表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)，胞內(nèi)酶活力為原始菌株的6.5 倍，和傳統(tǒng)的誘變育種相比，酶活性提高幅度更大。本研究不僅獲得了β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活有較大提高的突變株，還獲得了高效表達(dá)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，這些都為熱穩(wěn)定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶的進(jìn)一步研究和工業(yè)化應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Breeding of High-Yield β-1,3-1,4-Glucanase-Producing Strain by Mutagenesis, and Cloning and Expression of β-1,3-1,4-Glucanase Gene

CHEN Ji, GAO Peng, LU Zhaoxin, Lü Fengxia, ZHANG Chong, ZHAO Haizhen, BIE Xiaomei*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to obtain a high-yield β-1,3-1,4-glucanase producing strain, Bacillus altitudinis YC-9 was used as the starting strain and mutagenized sequentially with nitrosoguanidine (NTG) and N+beam. The preliminary and secondary screening results showed that strain N-2-2 and 10-30s-3 had high ability to produce β-1,3-1,4-glucanase, with a yield of 28.6 and 36.1 U/mL, which revealed a 2.36- and 2.98-fold increase compared with that of the original strain, respectively, while exhibiting reduced growth rates. Furthermore, the β-1,3-1,4-glucanase gene was successfully cloned and expressed in E. coli. The intracellular activity was 79.2 U/mL, a 6.5-fold increase compared with the original strain, when induced at 30 ℃ for 6 h.

Bacillus altitudinis; β-1,3-1,4-glucanase; nitrosoguanidine (NTG) mutagenesis; N+beam implantation; heterologous expression

TS201.3

A

1002-6630（2015）01-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201501034

2014-03-14

陳計(jì)（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2011108007@njau.edu.cn

*通信作者：別小妹（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛吧锛夹g(shù)。E-mail：bxm43@njau.edu.cn