康懷彬，肖天天，李凈凈，楊 橋，楊華田，尤曉顏,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

嗜冷普魯蘭酶產(chǎn)生菌NX-1的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

康懷彬1，肖天天1，李凈凈1，楊 橋2，楊華田1，尤曉顏1,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

從南極海泥樣品中分離得到一株產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的假交替單胞菌菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1。以菌株NX-1為研究對(duì)象，對(duì)菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，菌株NX-1所產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最適作用溫度為20 ℃，最適作用pH值為7.0，在最適條件下，酶的半衰期約為120 min；菌株NX-1的最適產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)溫度20 ℃、接種量1%、培養(yǎng)基各組分含量分別為蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L。優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶可達(dá)25.172 U/mL，相比優(yōu)化前提高25.1%。

嗜冷普魯蘭酶；假交替單胞菌；發(fā)酵；正交試驗(yàn)

淀粉作為一種重要原料被廣泛應(yīng)用于食品加工、生物能源等工業(yè)領(lǐng)域[1]。工業(yè)用淀粉質(zhì)原料中通常含有75%～85%的支鏈淀粉，支鏈淀粉中α-1,6-糖苷鍵的水解程度將直接影響到淀粉質(zhì)原料的利用效率[2]。為此，在淀粉制糖工業(yè)中，通常通過(guò)添加一定量的普魯蘭酶來(lái)提高支鏈淀粉的利用效率。該酶可以特異性地水解普魯蘭糖、支鏈淀粉等分枝多糖分子內(nèi)的α-1,6-糖苷鍵，生成相應(yīng)的麥芽三糖和直鏈多糖[3]。研究表明，在淀粉糖化過(guò)程中，添加一定量的普魯蘭酶，不僅可以降低糖化酶的用量，還可以顯著提高淀粉的糖化效率、縮短反應(yīng)時(shí)間，因此在淀粉深加工和生物能源等工業(yè)部門具有廣泛的應(yīng)用前景[4-5]。

普魯蘭酶最早從肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中分離得到[6]，其獨(dú)特的性狀及其在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛能，使得不同類型的普魯蘭酶相繼從不同類型的微生物中分離得到[1,3-4]。一些普魯蘭酶的基因也不斷被克隆、鑒定，以及異源表達(dá)[4,7-9]，少數(shù)普魯蘭酶的晶體結(jié)構(gòu)也得到了解析[10-12]，為開展普魯蘭酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)。在淀粉加工工業(yè)中，由于淀粉液化和糖化的溫度不同，液化轉(zhuǎn)入糖化時(shí)還需要降溫等工序，因此研究人員希望篩選得到耐熱性好的普魯蘭酶，將糖化和液化過(guò)程統(tǒng)一起來(lái)，從而簡(jiǎn)化工藝、降低成本[13]。目前關(guān)于普魯蘭酶的研究主要集中于嗜熱、超嗜熱普魯蘭酶[14-16]，而對(duì)于嗜冷普魯蘭酶的研究國(guó)內(nèi)目前還尚未開展，國(guó)外近期才有相關(guān)研究報(bào)道[17-18]。嗜冷普魯蘭酶能夠在低溫條件下水解支鏈淀粉中的α-1,6-糖苷鍵，如果與低溫淀粉酶配合使用可以有效減少淀粉糖化過(guò)程中的能源消耗，在淀粉加工工業(yè)自身節(jié)能降耗要求的背景下，開展嗜冷普魯蘭酶的應(yīng)用研究具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究從南極低溫環(huán)境樣品中，以普魯蘭糖為唯一碳源篩選得到一株產(chǎn)低溫普魯蘭酶菌株（Pseudoalteromonas sp.）NX-1，實(shí)驗(yàn)不僅對(duì)菌株所產(chǎn)低溫普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)行了測(cè)定，并且通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了菌株的最適產(chǎn)酶條件，為開展低溫普魯蘭酶的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

南極海泥樣品來(lái)自雪龍?zhí)柕?9次科考取樣，由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所提供。樣品編號(hào)為P5-10和P5-4，取樣點(diǎn)位置坐標(biāo)分別為59°30″S/043°00″W和60°00″S/042°00″W。

普魯蘭糖（生物純（C37H62O30）n） 生工生物工程（上海）股份有限公司；API 50CH試劑盒 法國(guó)梅里埃公司；其他試劑均為分析純。

鑒別培養(yǎng)基：普魯蘭糖3 g/L、蛋白胨10 g/L、人工海水1 000 mL、瓊脂2.0%，pH值自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L、人工海水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

GeneAmp?9700 PCR儀 美國(guó)生命技術(shù)公司；UV-1800型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；D-37520型高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；HYL-C型組合式溫控?fù)u床太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D潔凈工作臺(tái)蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

稱取1 g南極海底沉積物泥樣，加入到10 mL滅菌人工海水中，超聲分散（200 W，超聲1 s，停4 s，共15 個(gè)循環(huán)）后取1 mL培養(yǎng)液做梯度稀釋，涂布于篩選培養(yǎng)基的平皿中，置于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取平皿中長(zhǎng)出的菌株，采用影印接種法將菌株轉(zhuǎn)接入篩選培養(yǎng)基平皿中，在平皿中分別噴灑魯格氏碘液和無(wú)水乙醇并觀察水解圈情況，挑取有水解圈的菌株接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，20 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液中普魯蘭酶活力。

1.3.2 菌株的鑒定及進(jìn)化分析

采用酚-氯仿法人工提取基因組DNA[19]，采用通用引物27F和1492R擴(kuò)增能菌株16S rRNA基因序列，引物序列為：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：AAGGAGGTGATCCAAGCC。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性60 s，58 ℃退火，40 s；72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物切膠純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序后的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定種屬類別，并使用Mega 5軟件采用鄰接法聚類構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。采用API 50CH試劑盒（法國(guó)梅里埃）鑒定菌株對(duì)不同碳源的利用情況，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.3 嗜冷普魯蘭酶活力的測(cè)定

采用粗酶液測(cè)定嗜冷普魯蘭酶活力，收集發(fā)酵液，8 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定酶活力[20]。酶活力單位定義：在pH 7.0、溫度20 ℃條件下，每分鐘從普魯蘭糖底物釋放相當(dāng)于1 μmol葡萄糖還原量所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.4 嗜冷普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

在溫度為10、15、20、28、37、42 ℃條件下分別測(cè)定嗜冷普魯蘭酶的酶活力和菌懸液光密度（OD600nm）值，確定其最適反應(yīng)溫度；在最適溫度下，測(cè)定不同pH 值（4～9）條件下嗜冷普魯蘭酶的酶活力，確定其最適反應(yīng)pH值，pH 4～6.5采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L），pH 7～9采用Tris-HCl緩沖液（1 mol/L）；在最適pH值條件下，將酶液分別置于10、20、28、37、42 ℃條件下維持0、20、40、60、80、100、120 min，測(cè)定嗜冷普魯蘭酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

選取不同碳源、氮源、金屬離子及磷酸根離子加入含有100 mL無(wú)菌人工海水溶液的250 mL錐形瓶中，以1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，在20 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。固定其他條件不變，分別考察碳源（蔗糖、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、乳糖、糊精等）及碳源質(zhì)量濃度（蔗糖5～40 g/L）、氮源（蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨等）及氮源質(zhì)量濃度（蛋白胨5～40 g/L）、金屬離子（氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、氯化鐵等）及金屬離子質(zhì)量濃度（鈣離子0～0.8 g/L）、磷酸根離子質(zhì)量濃度（0～16 g/L）對(duì)菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

根據(jù)L9（34）正交表選取不同質(zhì)量濃度的蔗糖、蛋白胨、鈣離子及磷酸根離子組合配制發(fā)酵培養(yǎng)基。向含有100 mL人工海水溶液的250 mL錐形瓶中分別加入各組成分，以1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，在20 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，分別考察各組發(fā)酵培養(yǎng)基組分對(duì)低溫普魯蘭酶發(fā)酵效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定及生理生化性質(zhì)

圖1 菌株NX-1的分離鑒定結(jié)果Fig.1 Isolation and identifi cation of strain NX-1

初篩共分離得到10 株產(chǎn)普魯蘭酶菌株（圖1），通過(guò)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)初篩得到的菌株的產(chǎn)酶活力進(jìn)行測(cè)定，其中6 株菌株能夠檢測(cè)到普魯蘭酶的活性，表明這些菌株能夠合成外泌型普魯蘭酶分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。這6 株菌株中，菌株NX-1的產(chǎn)酶活力最高（20.12 U/mg），通過(guò)16S rRNA測(cè)序比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)菌株NX-1與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）物種相近，16S rRNA進(jìn)化關(guān)系表明菌株NX-1與游海假交替單胞菌株（Pseudoalteromonas haloplanktis）最為接近，并與紫菜假交替單胞菌株（Pseudoalteromonas porphyrae）聚為獨(dú)立分枝（圖1c），表明菌株NX-1是屬于假交替單胞菌屬的一個(gè)物種，將菌株NX-1命名為Pseudoalteromonas sp. NX-1。菌株NX-1的最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃（圖2c），形態(tài)為短桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陰性菌，菌落呈乳白色凸起、光滑濕潤(rùn)、不透明、邊緣整齊。采用梅里埃金標(biāo)準(zhǔn)微生物生理生化檢測(cè)試劑盒（API 50CH）對(duì)菌株NX-1的碳源利用情況進(jìn)行了定性測(cè)定，結(jié)果表明菌株NX-1可以利用阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、松二糖等多種碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，但不能利用葡萄糖、果糖、甘露糖生長(zhǎng)。

2.2 嗜冷普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)

圖2 菌株NX-1所產(chǎn)普魯蘭酶酶學(xué)性質(zhì)分析Fig.2 Enzymatic properties of pullulanase from the psychrophilic strain

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)條件下（pH 4～9，溫度10～42 ℃）均可以檢測(cè)到普魯蘭酶的酶活力，該酶的最適pH值為7.0，與之前報(bào)道的一些普魯蘭酶相近，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株TU、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株FDTA-13、芽孢桿菌（Bacillus fl avocaldarius）菌株KP122以及Rhodothermus marines[3]。菌株NX-1所產(chǎn)普魯蘭酶的最適催化溫度為20 ℃，按照文獻(xiàn)對(duì)于低溫酶的分類[21]，其屬于嗜冷酶的范疇，因此確定該酶為嗜冷普魯蘭酶。對(duì)該嗜冷普魯蘭酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定（圖2d），結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶在不同溫度下的穩(wěn)定性均呈下降趨勢(shì)，在120 min后，相對(duì)酶活力降低超過(guò)36.1%；在不同處理溫度下，隨著溫度的升高，酶的穩(wěn)定性呈快速下降趨勢(shì)，42 ℃保持120 min后，相對(duì)酶活力降低超過(guò)61.3%。在最適作用溫度條件下（20 ℃），酶的半衰期約為120 min（圖2d）。

2.3 培養(yǎng)基組分對(duì)菌株NX-1產(chǎn)酶的影響

2.3.1 不同種類碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖3 不同碳源對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on the yield of pullulanase

由圖3a可知，菌株NX-1不能利用單糖葡萄糖、二碳糖乳糖和三碳糖甘油為碳源生長(zhǎng)產(chǎn)普魯蘭酶，但可以利用二碳糖蔗糖，并且在所有碳源中蔗糖對(duì)菌株NX-1產(chǎn)酶影響最大，在以蔗糖為唯一碳源的條件下，普魯蘭酶活力可達(dá)31.29 U/mL。對(duì)于所選取的4 種不同類型的淀粉，結(jié)果顯示玉米淀粉、紅薯淀粉和馬鈴薯淀粉對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響接近，而可溶性淀粉效果要低于上述3 種淀粉。在這4 種淀粉質(zhì)碳源中，玉米淀粉要略優(yōu)于其他3 種淀粉，在實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的普魯蘭酶活力可達(dá)24.29 U/mL。因此，蔗糖是最適合菌株NX-1產(chǎn)酶的碳源。實(shí)驗(yàn)還考察了不同蔗糖用量對(duì)菌株NX-1產(chǎn)酶的影響（圖3b），結(jié)果表明當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，普魯蘭酶活力最高，為31.41 U/mL。

2.3.2 不同氮源對(duì)菌株NX-1產(chǎn)酶的影響

以蔗糖（20 g/L）為碳源，通過(guò)在培養(yǎng)基中分別添加不同種類的氮源（10 g/L），測(cè)定發(fā)酵液中普魯蘭酶的活力，考察不同氮源對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響。結(jié)果表明（圖4a），菌株NX-1可以利用有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源生長(zhǎng)產(chǎn)普魯蘭酶，但有機(jī)氮源要優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源硫酸銨。在6 種有機(jī)氮源中，蛋白胨對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響最大，玉米漿次之，大豆蛋白胨和牛肉膏作用相近，酵母膏對(duì)產(chǎn)酶影響最小。實(shí)驗(yàn)條件下，以蛋白胨為唯一氮源，發(fā)酵液普魯蘭酶酶活力可達(dá)25.26 U/mL，是菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的最適氮源?？疾觳煌鞍纂擞昧繉?duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響（圖4b），發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，對(duì)促進(jìn)菌株產(chǎn)普魯蘭酶作用最好。

圖4 不同氮源對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the yield of pullulanase

2.3.3 不同金屬離子對(duì)菌株NX-1產(chǎn)酶的影響

圖5 不同金屬離子對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.5 Effect of different metal ions on the yield of pullulanase

以蔗糖（20 g/L）為碳源、蛋白胨（10 g/L）為氮源，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.4 g/L的不同種類的金屬鹽（CaCl2、MgCl2、FeCl3、NaCl、KCl、MnCl2），以不加金屬鹽離子作為對(duì)照，考察不同金屬離子對(duì)產(chǎn)普魯蘭酶的影響。結(jié)果表明（圖5a），與對(duì)照相比，Na+、K+、Ca2+、Mn2+對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶均有一定的促進(jìn)作用，其中鈣離子對(duì)菌株NX-1的產(chǎn)酶促進(jìn)作用最高，酶活力增加27%；Mn2+促進(jìn)作用最低，僅為0.26%。相比較以上金屬離子，Mg2+和Fe3+在該質(zhì)量濃度下對(duì)菌株產(chǎn)酶具有抑制作用，其中Fe3+完全抑制菌株產(chǎn)酶。根據(jù)以上結(jié)果確定Ca2+是最適合菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的金屬離子。考察不同Ca2+質(zhì)量濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響（圖5b），發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中CaCl2質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)，對(duì)促進(jìn)菌株產(chǎn)普魯蘭酶作用最好。

2.3.4 磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響

劉逸寒等[2]研究表明，磷酸鹽對(duì)枯草芽孢桿菌工程菌株產(chǎn)普魯蘭酶具有促進(jìn)作用，基于此，本實(shí)驗(yàn)以蔗糖（20 g/L）為碳源、蛋白胨（10 g/L）為氮源，在培養(yǎng)基中添加0.4 g/L的氯化鈣，考察不同質(zhì)量濃度Na2HPO4對(duì)菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的影響。由圖6可知，磷酸根對(duì)菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶具有一定的影響，當(dāng)磷酸鹽質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，對(duì)菌株NX-1產(chǎn)酶促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng)，發(fā)酵液中普魯蘭酶活力達(dá)到最高（32.322 U/mL），此后隨著磷酸鹽質(zhì)量濃度的升高，發(fā)酵液中普魯蘭酶活力逐漸降低。

圖6 磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的影響Fig.6 Effect of phosphate concentration on the yield of pullulanase

2.4 菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶最佳培養(yǎng)基組分優(yōu)化

由單因素試驗(yàn)可知，培養(yǎng)基中蔗糖、蛋白胨、CaCl2和磷酸鹽的用量對(duì)菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶有促進(jìn)作用。為進(jìn)一步考察各因素之間的相互作用及最佳組合，采用L9（34）的設(shè)計(jì)方案進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），接種量1%、培養(yǎng)溫度20 ℃的條件下，蔗糖和蛋白胨為菌株NX-1產(chǎn)普魯蘭酶的主要影響因素，4 個(gè)因素的影響程度依次為：蔗糖質(zhì)量濃度＞蛋白胨質(zhì)量濃度＞Na2HPO4質(zhì)量濃度＞CaCl2質(zhì)量濃度。各因素的最優(yōu)組合為：蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L，此時(shí)普魯蘭酶活力可達(dá)25.172 U/mL，較優(yōu)化前提高25.1%。

表1 培養(yǎng)基各組分正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 1 Results and variance analysis of orthogonal array experiments for optimization of medium components

3 結(jié) 論

嗜冷酶在低溫下可以保持較高的催化效率，能夠減少生產(chǎn)過(guò)程中的能耗、降低生產(chǎn)成本；此外在低溫條件下食品經(jīng)嗜冷酶處理有助于保持其品質(zhì)和風(fēng)味，并降低中溫菌污染的風(fēng)險(xiǎn)；在處理結(jié)束后嗜冷酶經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可失活，不需要復(fù)雜的后續(xù)處理手段。嗜冷酶的這些特性使其在乳品、果汁、肉類加工等食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，嗜冷酶資源的開發(fā)和應(yīng)用成為食品工業(yè)的一個(gè)重要研究方向[21-23]。本研究從南極海泥樣品中分離得到一株產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶假交替單胞菌菌株NX-1，并對(duì)菌株所產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，同時(shí)利用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)菌株產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，菌株NX-1所產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最適作用溫度為20 ℃，最適作用pH值為7.0，在最適條件下，酶的半衰期約為120 min；影響菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的主要因素依次為蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4和CaCl2，菌株NX-1產(chǎn)嗜冷普魯蘭酶的最佳培養(yǎng)條件為蔗糖15 g/L、蛋白胨15 g/L、CaCl20.5 g/L、Na2HPO46 g/L，在此條件下所得普魯蘭酶活力可達(dá)25.172 U/mL，較優(yōu)化之前提高25.1%。通過(guò)對(duì)嗜冷普魯蘭酶的研究可為進(jìn)一步研究其嗜冷機(jī)制、提高熱穩(wěn)定性、以及開展低溫普魯蘭酶的工業(yè)化應(yīng)用提供研究材料和理論指導(dǎo)。

[1] 姜楠, 宋詼, 王萍. 普魯蘭酶及其分泌相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(6): 725-731.

[2] 劉逸寒, 薄嘉鑫, 王亞品, 等. 枯草芽孢桿菌工程菌株產(chǎn)普魯蘭酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(7): 136-139.

[3] 聶堯, 嚴(yán)偉, 徐巖. 工業(yè)屬性普魯蘭酶的開發(fā)及其催化性能改善的研究進(jìn)展[J]. 生物加工過(guò)程, 2013, 11(1): 104-112.

[4] CHEN Wenbo, NIE Yao, XU Yan. Signal peptide-independent secretory expression and characterization of pullulanase from a newly isolated Klebsiella variicola SHN-1 in Escherichia coli[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 169(1): 41-54.

[5] ROY I, GUPTA M N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34(1): 26-32.

[6] RACHED J R. Pullulanase from Aerobacter aerogenes: production in a cell-bound state purifica- tion and properties of the enzyme[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1966, 22(3): 254-261.

[7] DUAN Xuguo, CHEN Jian, WU Jing. Optimization of pullulanase production in Escherichia coli by regulation of process conditions and supplement with natural osmolytes[J]. Bioresource Technology, 2013, 146: 379-385.

[8] WU Hawei, YU Xinxin, CHEN Libing, et al. Cloning, overexpression and characterization of a thermostable pullulanase from Thermus thermophilus HB27[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2014, 95: 22-27.

[9] NIE Yao, YAN Wei, XU Yan, et al. High-level expression of Bacillus naganoensis pullulanase from recombinant Escherichia coli with autoinduction: effect of lac operator[J]. PLoS One, 2013, 8(10): e78416. doi: 10.1371/journal.pone.0078416.

[10] MIKAMI B, IWAMOTO H, MALLE D, et al. Crystal structure of pullulanase: evidence for parallel binding of oligosaccharides in the active site[J]. Journal of Molecular Biology, 2006, 359(3): 690-707.

[11] MALLE D, ITOH T, HASHIMOTO W, et al. Overexpression, purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase from Bacillus subtilis strain 168[J]. Aata Crystallographica Section F-structural Biology Communications, 2006, 62(4): 381-384.

[12] TURKENBURG J P, BRZOZOWSKI A M, SVENDSEN A, et al. Structure of a pullulanase from Bacillus acidopullulyticus[J]. Proteins, 2009, 76(2): 516-519.

[13] YU Liangjiao, WANG Shujun, Lü Mingsheng, et al. A GH57 family amylopullulanase from deep-sea Thermococcus siculi: expression of the gene and characterization of the recombinant enzyme[J]. Current Microbiology, 2011, 62(1): 222-228.

[14] BERTOLDO C, ARMBRECHT M, BECKER F, et al. Cloning, sequencing, and characterization of a heat-and alkali-stable type I pullulanase from Anaerobranca gottschalkii[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(6):3407-3416.

[15] DUAN Xuguo, CHEN Jian, WU Jing. Improving the thermostability and catalytic efficiency of Bacillus deramificans pullulanase by site-directed mutagenesis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(13): 4072-4077.

[16] 王淑軍, 呂明生, 李華鐘, 等. 深海古菌Thermococcus siculi HJ21 高溫普魯蘭酶基因的克隆及表達(dá)[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 309-312.

[17] RAJAEI S, HEIDARI R, SHAHBANI Z H, et al. A novel cold-adapted pullulanase from Exiguobacterium sp. SH3: production optimization, purifi cation, and characterization[J]. Starch-St?rke, 2014, 66(3/4): 225-234.

[18] QOURA F, ELLEUCHE S, BRUECK T, et al. Purification and characterization of a cold-adapted pullulanase from a psychrophilic bacterial isolate[J]. Extremophiles, 2014, 18(6): 1095-1102.

[19] MARMUR J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms[J]. Journal of Molecular Biology, 1961, 3(2): 208-218.

[20] 朱夢(mèng), 孫海彥, 彭明. 普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定與發(fā)酵條件的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(7): 136-140.

[21] 辛明秀, 周培瑾. 冷適應(yīng)微生物產(chǎn)生的冷活性酶[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2000, 40(6): 661-664.

[22] 呂明生, 王淑軍, 李華鐘, 等. 海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas fl avipulchra HH407產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(20): 298-303.

[23] SWATI J, TULASI S. Biotechnology of cold-active proteases[J]. Biology, 2013, 2(2): 755-783.

Screening of Psychrophilic Strain NX-1, a Pullulanase-Producing Bacterium and Optimization of Culture Conditions for Pullulanase Production

KANG Huaibin1, XIAO Tiantian1, LI Jingjing1, YANG Qiao2, YANG Huatian1, YOU Xiaoyan1,*
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)

In the present study, a psychrophilic pullulanase-producing strain, Pseudoalteromonas sp. NX-1, was isolated from Antarctic marine sediment samples with optimum growth temperature of 20 ℃. The enzymatic properties of pullulanase from strain NX-1 were investigated. The medium composition and culture conditions for pullulanase production by NX-1 were optimized by single factor and orthogonal array experiments. The results showed the optimum catalytic pH of the pullulanase was 7.0, and the half-life was 120 min at optimal catalytic conditions. The pullulanase activity of this isolate was infl uenced in decreasing order by the following medium components sugar, peptone, CaCl2and Na2HPO4. The optimal culture conditions were 20 ℃ and an inoculum size of 1% using a medium consisting of 15 g/L sugar, 15 g/L peptone, 0.5 g/L CaCl2and 6 g/L Na2HPO4. The yield of pullulanase was improved by 25.1% when compared to that obtained before optimization that before.

psychrophilic pullulanase; Pseudoalteromonas; fermentation; orthogonal experiments

Q815

A

1002-6630（2015）01-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201501023

2014-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200035）；河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（090061608）；河南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CXJJ-YJS-Z008）；河南科技大學(xué)大學(xué)生訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2013122）

康懷彬（1963—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及質(zhì)量控制。E-mail：khbin001@163.com

*通信作者：尤曉顏（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xiaoyanyou@hasust.edu.cn