姜 偉，肖代雯，楊永長(zhǎng)，劉 華，喻 華，黃文芳，李順君

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科（成都 610072）

大腸埃希菌（Escherichia coli，ECO）是重要的醫(yī)院感染致病菌，可通過(guò)接觸、呼吸道氣溶膠吸入或侵入性操作等引起菌血癥或呼吸道、尿路及傷口感染等，給臨床治療造成極大困難［1－3］。目前國(guó)內(nèi)外研究通常采用管家基因（如16SrRNA）測(cè)序法鑒定病原微生物，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)、操作繁瑣［4］。蛋白質(zhì)指紋技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、高通量、高靈敏性和高特異性的特點(diǎn)，主要用于分子或基因水平疾?。ㄈ缒[瘤）的早期檢測(cè)。本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期已建立的蛋白指紋技術(shù)與Fingerwave軟件結(jié)合的ECO快速診斷模型［5］，利用新近收集的臨床標(biāo)本進(jìn)行盲法驗(yàn)證，以期為該技術(shù)的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

收集四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院各科室2014年1－12月臨床標(biāo)本分離的菌株163株，經(jīng)VITEK－2全自動(dòng)微生物分析儀鑒定，其中ECO 81株，鮑曼不動(dòng)桿菌22株，肺炎克雷伯菌20株，銅綠假單胞菌15株，表皮葡萄球菌10株，金黃色葡萄球菌9株，陰溝腸桿菌6株。參考株為ECO株ATCC25922。

提取81株ECO細(xì)菌DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增細(xì)菌體內(nèi)蛋白分子伴侶DnaJ編碼基因，擴(kuò)增長(zhǎng)度約為719bp［5］。PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，所得產(chǎn)物序列與NCBI中基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

葡萄球菌和革蘭陰性桿菌分別接種于血平板和麥康凱瓊脂平板（安圖公司）［6］，于 35 ℃、6.5%CO2培養(yǎng)24h，然后挑取單個(gè)菌落再次接種于上述平板中，相同環(huán)境下培養(yǎng)24h。用接種環(huán)收集細(xì)菌至1.5mL離心管中，無(wú)菌雙蒸水洗滌3次，然后1 500r/min離心5min，離心半徑5cm，棄去上清，留取沉淀用于細(xì)菌蛋白提取。

1.3 細(xì)菌蛋白指紋圖譜檢測(cè)

參照我們前期研究方法［6］進(jìn)行細(xì)菌蛋白提取、PBSⅡ－C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀（Bio－Rad公司）參數(shù)設(shè)置及校正、蛋白指紋圖譜檢測(cè)。

1.4 獲取細(xì)菌蛋白指紋數(shù)據(jù)

采用Proteinchip軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，將標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)0.3～3.0的圖譜納入分析。統(tǒng)計(jì)前期篩選的19個(gè)標(biāo)志蛋白表達(dá)豐度，將其數(shù)據(jù)導(dǎo)入自建的Fingerwave軟件，設(shè)置鑒定閾值為0.7［5］。當(dāng)預(yù)測(cè)值≥0.7，歸為ECO；當(dāng)預(yù)測(cè)值＜0.7，歸為其他細(xì)菌。將模型鑒定結(jié)果與其他傳統(tǒng)方法及分子生物學(xué)方法進(jìn)行比較，計(jì)算靈敏度、特意度和符合率，評(píng)價(jià)模型診斷效能。

1.5 頭孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥的ECO蛋白指紋圖分析

頭孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦是臨床治療ECO感染的首選藥物［7］。篩選所收集菌株中對(duì)以上藥物均耐藥（9株）和均敏感（45株）的ECO蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)，對(duì)比分析兩組細(xì)菌蛋白表達(dá)的差異性。

2 結(jié)果

2.1 DnaJ基因測(cè)定結(jié)果

ECO的DnaJ基因擴(kuò)增產(chǎn)物均擴(kuò)增出目的條帶（圖1）。結(jié)果顯示與ECO符合率＞99%，確定為ECO（AB272648）。

圖1 ECO的DnaJ編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 蛋白標(biāo)志物在兩次檢測(cè)中的表達(dá)差異

ECO蛋白指紋圖譜（圖2）導(dǎo)入Biomarker Wizard軟件，對(duì)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)29個(gè)所有細(xì)菌共同表達(dá)的蛋白質(zhì)峰。統(tǒng)計(jì)前期篩選的19個(gè)標(biāo)志蛋白質(zhì)峰的表達(dá)豐度，除15 724蛋白質(zhì)峰在本次檢測(cè)中表達(dá)略有增高外，其余蛋白質(zhì)峰的表達(dá)均降低，表達(dá)豐度為2.55～30.90（表1）。

表1 篩選的19個(gè)ECO標(biāo)志蛋白表達(dá)在兩次檢測(cè)中的表達(dá)差異

2.3 ECO蛋白指紋數(shù)據(jù)模型的建立及評(píng)價(jià)

81例ECO中有9例判錯(cuò)，82例其他細(xì)菌中有13例判錯(cuò)。ECO蛋白指紋診斷模型檢測(cè)ECO的敏感度為88.9%（72/81），特異度為84.1%（69/82），符合率為86.5%（141/163）。

2.4 耐藥/敏感ECO蛋白表達(dá)的差異性

兩組差異蛋白質(zhì)峰有7個(gè)；與敏感菌株比較，耐藥菌株中表達(dá)增高的蛋白質(zhì)峰4個(gè)，分別為9 068、11 994、17 442、18 820m/z；表達(dá)降低的蛋白質(zhì)峰3個(gè)，分別為7 485、8 597、15 901m/z。

圖2 兩次檢測(cè)獲得的部分ECO蛋白指紋圖譜比較

3 討論

ECO已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一，其檢出率僅次于銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌。目前，開(kāi)發(fā)快速鑒定ECO感染的新技術(shù)或新方法，是臨床微生物學(xué)研究的重點(diǎn)之一［5］，從蛋白分子水平來(lái)檢測(cè)和鑒定病原微生物是其主要的研究方向。Bader［8］利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）技術(shù)鑒定了部分革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，結(jié)果表明，同種細(xì)菌間蛋白的表達(dá)相近，具有相似的蛋白指紋圖，因此根據(jù)細(xì)菌的蛋白指紋圖可快速鑒定細(xì)菌。我們前期的研究［5－6］也證明利用蛋白指紋圖譜技術(shù)及自建的Fingerwave軟件可快速鑒定多種細(xì)菌。本研究是對(duì)前期建立的ECO蛋白指紋數(shù)據(jù)模型的再次驗(yàn)證，結(jié)果顯示該檢測(cè)模型對(duì)ECO的檢測(cè)靈敏度和特異度分別為88.9%和84.1%，與傳統(tǒng)微生物學(xué)方法及分子生物學(xué)方法相比，符合率為86.5%。

我們兩次檢測(cè)均采用相同方法提取和處理細(xì)菌蛋白，使用相同的檢測(cè)儀器和參數(shù)。但是，與前期研究檢測(cè)結(jié)果相比，本研究獲得的部分蛋白指紋圖中的蛋白質(zhì)峰數(shù)目有所減少，聚類(lèi)分析后只得到29個(gè)共有蛋白質(zhì)峰，并且篩選的19個(gè)標(biāo)志蛋白中有18個(gè)存在表達(dá)降低，只有15 724蛋白質(zhì)峰表達(dá)略有增高，這可能與激光發(fā)射器的檢測(cè)效能下降有關(guān)。因此，在使用蛋白指紋圖譜儀的過(guò)程中，監(jiān)測(cè)和保證激光發(fā)射器的效能，建立標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程和質(zhì)量控制規(guī)則，對(duì)于保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性非常重要。本次研究ECO的鑒定符合率為86.5%，與前期研究結(jié)果（100.0%）相比，有所下降，提示建庫(kù)篩選的蛋白標(biāo)志物可能需進(jìn)一步優(yōu)化，但也可能是由于同種細(xì)菌間蛋白表達(dá)的差異性和多樣性導(dǎo)致。本研究對(duì)比分析了對(duì)頭孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥或敏感的兩組ECO蛋白指紋圖，發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)峰，表明蛋白指紋圖譜分析對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗生素也具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

此外，兩次研究分析后也發(fā)現(xiàn)蛋白指紋圖譜檢測(cè)存在一些不足：1）研究平臺(tái)相對(duì)復(fù)雜且成本較高；2）篩選的差異蛋白還需要進(jìn)一步鑒定，以確定蛋白的本質(zhì)。

綜上所述，利用蛋白指紋圖譜技術(shù)鑒定ECO，具有簡(jiǎn)單、快速、高通量的特性，在臨床微生物檢測(cè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，但需進(jìn)一步優(yōu)化建庫(kù)的各細(xì)菌蛋白質(zhì)峰譜，建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程和質(zhì)控規(guī)則，并對(duì)確立的模型進(jìn)行大樣本量和多中心的驗(yàn)證。

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